检测猪流行性腹泻病毒抗体的酶联免疫试剂盒的制作方法

本发明属于酶联免疫试剂盒技术领域，具体涉及一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的酶联免疫试剂盒，本试剂盒适用于临床猪群中猪流行性腹泻病毒血清抗体的快速检测。

背景技术：

猪流行性腹泻病(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的疾病，其症状与猪的传染性胃肠炎(tge)相似，主要包括腹泻，呕吐，厌食，脱水，和仔猪体重减轻等。尽管各年龄段猪均可感染并出现不同程度的症状，但仔猪病情特别严重，其中死亡率高达100％。这种疾病正在对养猪业造成严重损害。首次在比利时分离出病毒株，并命名为冠状病毒cv777。ped在欧洲的传播自2000年以来一直在控制之中，但该疾病在亚洲国家仍然流行，包括中国，韩国和日本。

目前猪流行性腹泻疾病尚缺乏有效的针对性的根治手段。在检测猪流行性腹泻病毒方面目前主要通过病毒分离鉴定、血清中和试验、免疫电镜观察(iem)、间接血凝试验(iha)、免疫焚光(if)，免疫组织化学技术，rt-pcr等技术。这些方法都存在不同程度的耗时时间长、所需仪器昂贵等缺点，不便于普遍开展监测工作。elisa法具有简便、快速、特异性强等优点，而且elisa检测抗体能够评价疫苗的免疫效果，但需要抗原纯度较高且免疫原性良好。pedvn基因全长l,326bp，为pedv的结构蛋白。研究发现n蛋白在pedv的结构蛋白中含量最高，也决定了n蛋白在病毒成熟粒子的感染过程中病毒组分含量最高，这说明n蛋白适合用作早期诊断靶蛋白。pedvn蛋白分子结构高度保守，在病猪感染初期，抗n蛋白的细胞免疫可以使感染动物康复，且能在体内产生抗n蛋白的高水平抗体，为pedv分子生物学诊断技术提供了研究依据，且具有很好的应用前景。

技术实现要素：

本发明根据猪流行性腹泻病毒的特点及其流行情况，对我国已报道pedv基因序列进行分析，筛选国内具有代表性的毒株n基因序列：根据genebank中已登录的国内流行的pedv序列，利用软件mega5.0和ncbi-blast进行分析，发现n基因在不同毒株之间具有良好的保守性，利用国内具有代表性的pedv毒株n蛋白作为包被抗原，提供了一种检测pedv抗体的elisa试剂盒及其应用。该elisa检测试剂盒以腹泻猪的血清为检测对象，可用于猪流行性腹泻病毒抗体的检测、流行病学调查等。

本发明的第一个目的是提供检测猪流行性腹泻病毒抗体的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒以猪流行性腹泻病毒n蛋白的重组蛋白为包被抗原。

作为优选，所述重组蛋白的制备方法为：(1)将pedvn基因使用bamhi与hindⅲ克隆至载体pet-28a中；(2)将重组质粒pet-30a-n转化大肠杆菌bl21(de3)，选择单克隆于37℃下进行培养，待od600值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mmol/liptg于37℃进行诱导，iptg诱导6h后，收集诱导表达后的菌体，超声破碎，离心后，取上清进行纯化，收集纯化的重组蛋白。

作为优选，所述纯化的具体方法为：镍柱纯化。

作为优选，所述试剂盒还包括以下组分：包被液、封闭液、血清稀释液、底物显色液和终止液。

作为优选，所述试剂盒还包括pedv标准阳性血清和pedv标准阴性血清。

本发明的第二个目的是提供上述酶联免疫试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

本发明的第三个目的是提供上述猪流行性腹泻病毒抗体的检测方法，所述检测不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：

(1)包被酶标板：将纯化后的重组pedvn蛋白作为包被抗原，用包被液将其稀释到0.25μg/ml，加入空白酶标板中，进行包被；

(2)洗涤酶标板；

(3)封闭酶标板：加入封闭液进行封闭；

(4)洗涤酶标板；

(5)加入猪血清一抗：取出已包被并封闭好的elisa板条，用血清稀释液将待检猪血清、pedv标准阴性和阳性血清分别稀释后，加入酶标板，37℃反应15分钟；

(6)洗涤酶标板；

(7)加入酶标二抗：用血清稀释液以1：10000的体积比稀释酶标猪二抗，加入稀释后的酶标猪二抗，进行反应；

(8)洗涤酶标板；

(9)显色：加入底物显色液进行显色；

(10)终止反应并读值：取出显色酶标板，加入终止液，在酶标仪上读取od450nm的光吸收值，计算平均值、s/p值并判定结果：当样品s/p值≥0.3时为阳性，＜0.3时为阴性。

作为优选，步骤(1)中，所述包被是在37℃包被2h。

作为优选，步骤(3)中，所述封闭是在37℃封闭2h。

作为优选，步骤(5)中，所述检猪血清、pedv标准阴性和阳性血清的稀释体积比为1:20；

作为优选，步骤(7)中，所述酶标二抗在37℃下反应15分钟；

作为优选，步骤(9)中，加入底物显色液后，在37℃避光显色10分钟。

本发明技术方案的设计思路为：

本发明对我国已报道pedv基因序列进行分析，筛选国内具有代表性的毒株n基因序列：根据genebank中已登录的国内流行的pedv序列，利用软件mega5.0和ncbi-blast进行分析，发现n基因在不同毒株之间具有良好的保守性。利用swiss-model和dna-star软件分析发现利用n蛋白作为包被抗原可检测不同线性表位、构象表位的抗体。

本发明的有益效果为：

(1)本发明的pedvelisa检测试剂盒以pedvn蛋白作为包被抗原，利用pet-28a载体成功将n蛋白表达为具有功能性的可溶性蛋白，可检测到针对不同线性表位，构象表位的抗体，提高了检测的敏感性以及检测结果的可靠性；

(2)原核诱导表达，蛋白产量高，生产工艺较真核表达抗原简便易行；

(3)本发明表达的蛋白为具有功能性的可溶性蛋白，可检测针对不同线性表位、构象表位的抗体，弥补了现有pedv单抗竞争、阻断检测试剂盒敏感性不足的缺点，提高了检测结果的准确率；

(4)本发明的pedvelisa检测试剂盒用以检测pedv抗体，该pedvelisa试剂盒敏感性、特异性均良好。同时该试剂盒所需要的样品量少操作方法简便快捷，其造价成本低廉，适合用于畜牧养殖业中牛猪流行性腹泻病的诊断及实验室中pedv病原的检测，在养殖业的发展中具有重大意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为重组质粒pet-28a-n诱导表达sds-page鉴定。

图2为利用镍柱纯化重组蛋白后sds-page鉴定。

图3为抗原包被浓度分析。

图4为血清稀释度分析。

图5为酶标二抗反应时间分析。

图6为终止液选择分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1重组pedvn蛋白表达载体pet-28a-n构建及重组pedvn蛋白诱导表达及鉴定

pedvn蛋白基因通过bamhi与hindⅲ酶切位点克隆至原核表达载体pet-28a，将重组质粒pet-30a-n转化大肠杆菌bl21(de3)，挑取单菌落于37℃，摇床转速为180r/min培养条件下进行扩大培养，当活化培养的菌液od600值达到0.6-0.8时，取2ml菌液，加入终浓度为0.1mmol/liptg于37℃进行诱导，摇床转速为180r/min，iptg诱导6h后，取1ml菌液，12000r/min离心1min，弃上清，加入100μlpbs重悬。

将重悬的菌液经超声波破碎仪破碎，12000r/min离心5min后，分别取上清和沉淀加入适量的sds上样缓冲液制备样品，99℃金属浴煮样10min，进行sds-page检测，电泳结果见图1。

图1为重组质粒pet-28a-n诱导表达sds-page鉴定，m-标记；1-菌液诱导前蛋白表达；2-菌液超声裂解后上清液；3-菌液超声破碎后蛋白沉淀。

大量诱导菌液，超声破碎后取上清利用镍柱进行纯化，收集所纯化的蛋白。经sds-page电泳检测可见纯化效果良好，电泳结果见图2。使用微量紫外分光光度计进行蛋白浓度测定，分装后于-80℃保存。

图2为利用镍柱纯化重组蛋白后sds-page鉴定图。m-标记；1-蛋白上样前样品；2-蛋白上样后流穿液；3-杂蛋白洗脱流穿液；4，5-目的蛋白洗脱样品。

利用镍柱进行纯化时，具体的操作为：

1.将10ml离心蛋白上清+5mlni-nta填料，4℃旋转孵育3h左右；

2.回收流穿液，流穿液(20mmna2hpo4+500mmnacl,ph8.0)+20mm咪唑洗100ml，流速要慢；

3.流穿液(20mmna2hpo4+500mmnacl,ph8.0)+40mm咪唑洗100ml；

4.流穿液+1m咪唑洗脱目的蛋白，用量10ml。

实施例2检测猪流行性腹泻病毒的酶联免疫试剂盒的构建及检测方法的建立

以上述纯化的重组pedvn蛋白为包被抗原，pedv标准阳性血清为对猪进行四次免疫pedv后所采的血清，pedv标准阴性血清为未免疫pedv的健康四周龄猪血清，pedv通过优化各个反应条件，建立检测猪流行性腹泻病毒的酶联免疫试剂盒。

1.抗原最适包被浓度的确定

将步骤1制备得到的纯化后的重组pedvn蛋白作为包被抗原，用包被液将其分别稀释到0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml，以100μl/孔的量滴加到96孔板中，组成方阵，37℃包被过夜；弃去抗原液，用洗涤液充分洗涤三次，200μl/孔，5min/次，加入封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h；弃去封闭液，用上述的操作方法洗涤；用血清稀释液稀释pedv标准阳性血清，然后将pedv标准阳、阴性血清以每孔100μl的量分别加入到96孔板中，在37℃的条件下作用30min；弃去血清，用上述的操作方法洗涤；用酶标二抗稀释液稀释酶标二抗，加入稀释的酶标二抗，100μl/孔，在37℃的条件下作用30min；弃去酶标二抗，用上述操作方法洗涤，尽量弃去孔内液体，加入底物显色液100μl/孔，37℃避光显色15min，最后加入终止液终止反应；用酶标仪在450nm波长下测定od值，结果见图3。比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的包被抗原的稀释度为抗原包被最佳浓度，即最佳抗原包被浓度为0.25μg/ml。

图3为抗原包被浓度分析。

2.包被条件的选择

以最佳抗原浓度包被酶标板，分别在4℃反应过夜、37℃反应1h后4℃反应过夜、37℃反应2h，进行包被。用已知的阴、阳性血清进行elisa检测，比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的条件为抗原包被的最佳条件，即37℃包被2h。

3.封闭条件的确定

在其他条件固定的情况下，将封闭液分别在37℃封闭30min、60min、90min和120min，用已知的阴、阳性血清进行elisa检测，比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的封闭条件为最佳封闭条件，即37℃反应120min。

4.血清最适稀释度的确定

最佳抗原包被浓度包被酶标板，其他条件固定，将pedv标准阳、阴性血清依次做l：10、l：20、l：40、l：80稀释后，以每孔100μl的量分别加入到已包被抗原的酶标板中，在其他条件不变的情况下进行elisa检测，比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的血清的稀释度为血清的最佳稀释度，即稀释度为1：20。

图4为血清稀释度分析。

5.最适抗原抗体反应时间的确定

以最佳抗原包被浓度包被酶标板，使用封闭液封闭，加入最佳稀释度的血清后，37℃分别孵育10、15、30、45min。在其他条件不变的情况下进行elisa检测，比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的抗原抗体反应时间为最佳的时间，即反应15min。

6.酶标二抗反应时间的确定

在其他条件不变的情况下加入酶标猪二抗，37℃分别孵育5、10、15、20min，进行elisa检测，比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的酶标二抗为二抗的最佳反应时间，即反应15min。

图5为酶标二抗反应时间分析。

7.最适显色时间的确定

加入显色液后于37℃避光下分别作用3、4、5、6、8、10、12、15min，在其他条件为上述所优化的最佳条件，比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的显色时间为最佳显色时间，即显色10min。

8.终止液的选择

选择4种不同组分的终止液，浓度分别为：1m、1.25m、1.5m、2.0m的硫酸，在其他条件为最优条件下进行elisa检测，比较阴阳性血清的od450值，选择阳性与阴性od比值最大时的终止液为最佳终止液，即1.5m的硫酸。

图6为终止液选择分析图。

9.阴阳性临界值的确定

取经中和试验和间接免疫荧光检测猪流行性腹泻病毒抗体为阴性的200份猪血清，按已确定的条件进行elisa，用酶标仪仪在450nm波长下测定od值，计算od450的平均值x及标准方差sd，阴阳性临界值＝x十3sd。

经计算200份血清的s/p平均值x＝0.179，sd＝0.041，因此elisa阴阳性临界值＝0.179+3×0.041＝0.3。因此，当样品s/p值≥0.3时为阳性，＜0.3时为阴性。

10.检测猪流行性腹泻病毒的酶联免疫试剂盒的建立

本发明的检测猪流行性腹泻病毒的酶联免疫试剂盒包括以下组分：

(1)空白酶标板；

(2)纯化后的重组pedvn蛋白；

(3)包被液：兰州博瑞生物科技有限公司提供，仅限于实验室科研(包被液货号：br-001)；

(4)洗涤液：pbst；

(5)封闭液：pbst+5％脱脂奶粉；

(6)血清稀释液：兰州博瑞生物科技有限公司提供，仅限于实验室科研(血清稀释液货号：br-002)；

(7)pedv标准阳性血清；

(8)pedv标准阴性血清；

(9)酶标猪二抗；由兰州博瑞生物科技有限公司提供，仅限于实验室科研；

(10)底物显色液：tmb(购自索莱宝)；

(11)终止液：1.5m硫酸。

11.检测猪流行性腹泻病毒的酶联免疫试剂盒操作程序的确定

按以上各项所确定的最佳操作条件，确定elisa操作程序为：

1、包被酶标板：将纯化后的重组pedvn蛋白作为包被抗原，用包被液将其稀释到0.25μg/ml，以100μl/孔的量分别滴加到96孔空白酶标板中，组成方阵，37℃包被2h；

2、洗涤酶标板：拿出包被好的酶标板，弃去抗原包被液，用洗涤液充分洗涤三次，200μl/孔，5min/次，弃尽孔中液体；

3、封闭酶标板：加入封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h；

4、洗涤酶标板：弃去封闭液，用步骤2的操作方法洗涤；

5、加入猪血清一抗：取出已包被并封闭好的elisa板条，用血清稀释液将待检猪血清、pedv标准阴性和阳性血清分别做体积比为1：20的稀释后，加入酶标板各孔，每孔100μl，每份待检血清与ped阴性、阳性血清各加2孔，37℃反应15分钟；

6、洗涤酶标板：弃去孔内液体，每孔用200μl洗涤液洗涤3次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；

7、加入酶标二抗：用血清稀释液以1：10000的体积比稀释酶标猪二抗，每孔加入100μl稀释后的酶标猪二抗，37℃反应15分钟；

8、洗涤酶标板：弃去孔内液体，每孔用200μl洗涤液洗涤3次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；

9、显色：每孔加入100μl底物显色液后，37℃避光显色10分钟；

10、终止反应并读值：取出显色酶标板，每孔加入100μl终止液；用酶标仪在450nm波长下读取各孔od值，计算平均值、s/p值并判定结果。当样品s/p值≥0.3时为阳性，＜0.3时为阴性。

实施例3建立的猪pedv酶联免疫试剂盒的应用

我们对来自周边某猪场的25份猪血清分别利用武汉科前的pedvelisa试剂盒及本发明的方法进行检测，结果表明其中有4份血清前者检测结果为阴性，而本发明检测结果为阳性，比对符合率84％，随后利用艾德士pedvelisa试剂盒进行复检，结果显示这四份血清为阳性，经检验，以及与市场所售pedv检测试剂盒比较分析，本发明的pedvelisa试剂盒敏感性、特异性均良好。

随后又对47份血清分别使用艾德士pedvelisa试剂盒及本发明进行检测，结果符合率为100％。

最后，对同一批96份血清用本发明检测方法进行三次重复检测，结果显示检测重复率99％。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。