超高效液相色谱－四级杆/高分辨质谱法测定花生中黄曲霉毒素和农药残留的方法与流程

本发明涉及一种花生中黄曲霉毒素和农药残留的检测方法，尤其涉及一种超高效液相色谱－四级杆/高分辨质谱法测定花生中4种黄曲霉毒素和11种农药残留的方法，其属于分析化学领域。

背景技术：

花生是我国重要的粮油和经济作物之一，约占世界花生总产量的60％。我国的花生和花生油的总产量在世界其他国家中遥遥领先，并成为世界第一花生出口大国。随着花生进出口贸易的发展，越来越将真菌毒素和农药残留作为其进出口的技术性贸易壁垒，也因此对我们的检测技术提出了挑战。

黄曲霉毒素(aflatoxin)具有极强毒性，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类具有生物活性的次级代谢产物，人和动物摄入可引起致畸、致癌和致突变，是食品安全和公共卫生的一大威胁。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉群的黄曲霉和寄生曲霉真菌产生，主要包括b1、b2、g1、g2及b1、b2在体内经过羟化衍生而成的代谢产物m1、m2等10多种。花生是最容易受黄曲霉毒素污染的农产品之一，黄曲霉对其有极高的亲和性，由于黄曲霉毒素的强致癌作用，世界卫生组织及各国都加强了对花生及其制品中黄曲霉毒素的检测工作，并制订了严苛的黄曲霉毒素b1及总量(包括b1、b2、g1、g2)的限量要求。因此,控制花生中的黄曲霉毒素(b1、b2、g1、g2)污染具有重要意义。

花生在生产、运输过程中易受多种病虫害的侵袭，所以需要使用大量的农药加以防治，因此造成花生中农药残留超标的现象。近年来，由于我国农药的不科学量标准，造成我国出口花生遭扣留和退运情况时有发生，农药残留问题已成为我国花生出口继黄曲霉毒素之后又一关键限制因素。

目前，花生中的黄曲霉毒素检测主要分为酶联免疫法、薄层色谱法、高效液相法及高效液相色谱-串联质谱法。花生中的农药残留检测主要是凝胶渗透色谱、基质固相分散萃取、quechers(quick、easy、cheap、effective、ruggedandsafe)等方法提取，液相色谱仪、液相色谱－串联质谱仪、气相色谱仪、气相色谱质谱仪检测。然而这些黄曲霉毒素和农药残留检测方法相对较为独立，不能实现同时检测；对基质的抗干扰能力不足，易出现假阳性。高分辨质谱(orbitrap)具有高通量、高选择性、高灵敏度等优势，抗基体干扰能力强，适用于多种目标化合物的筛查和确证分析。目前使用高分辨质谱法同时检测花生中黄曲霉毒素和农药残留的研究尚未见文献报道。

技术实现要素：

本发明针对上述不足，提供一种超高效液相色谱－四级杆/高分辨质谱法测定花生中4种黄曲霉毒素和11种农药残留的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种超高效液相色谱－四级杆/高分辨质谱法测定花生中黄曲霉毒素和农药残留的方法，步骤如下：(1)4种黄曲霉毒素和11种农药残留标准品的准备，(2)花生样品前处理，(3)液相色谱检测条件:ultimate3000快速液相色谱仪，thermohypersilgoldc18柱(100mm×2.1mm，1.9μm)，柱温40℃，进样量10μl；流动相:a为含0.1％(体积分数)的甲酸水溶液，b为甲醇，流速:0.35ml/min，梯度洗脱条件:0～0.8min，2％b；0.8～3min，2％～24％b；3～4min，24％b；4～6min，24％～95％b；6～9min，95％b；9～9.5min，95％～2％b；9.5～12min，2％b，(4)质谱检测条件:四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪q－exactive，加热电喷雾离子源(hesi)温度为350℃；毛细管电压为3.5kv；离子传输管温度为320℃；鞘气流速为40unit，辅助气流速为10unit，fullms/dd-ms²扫描模式:采集范围为100～600m/z，正离子采集；一级质谱分辨率为70000fwhm，二级质谱分辨率为17500fwhm；归一化碰撞能量(nce)为30ev、45ev、60ev，(5)绘制标准曲线，(6)回收率和精密度方法学实验。

优选的，黄曲霉毒素和农药残留标准品的准备：配置混合标准溶液ⅰ和混合标准溶液ⅱ，混合标准溶液ⅰ包括黄曲霉毒素b1(afb1)、黄曲霉毒素g1(afg1)、啶虫眯、乙草胺、多菌灵、克百威、毒死蜱、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、吡虫啉、嘧霉胺、戊唑醇、噻虫，混合标准溶液ⅱ包括黄曲霉毒素b2和黄曲霉毒素g2。

优选的，花生样品前处理方法如下：样品经粉碎混匀后，准确称取2.00g样品置于聚丙烯具塞离心管中，加入10ml乙酸-乙腈-水提取液(1:84:15，v/v/v)，涡旋混匀1min，加入1.0g硫酸镁、0.3g无水乙酸钠后，立即振摇1min，4℃下以5000r/min离心5min使固液分离，转移上清液加入1.0g硫酸镁、100mgpsa与400mgc18硅胶混合体系进行分散固相萃取净化，涡旋振荡1min，然后于5000r/min离心5min，取5ml上清液于40℃水浴中氮吹至干，加入甲醇-水(50:50,v/v)定容至1ml，充分混匀后,过0.22μm滤膜，进样分析。

优选的，绘制标准曲线方法如下：采用空白的花生基质溶液，准确配制浓度分别为1μg/l、2μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l的混合标准溶液ⅰ和浓度分别为0.25μg/l、0.5μg/l、1.25μg/l、2.5μg/l、5.0μg/l的混合标准溶液ⅱ，经高分辨质谱检测，以色谱峰面积(y)为纵坐标，对照溶液的质量浓度(x，μg/l)为横坐标绘制标准曲线，以各目标物在线性范围中满足回收率值在60％～120％区间内的最低浓度为方法的定量限。

优选的，回收率和精密度方法学实验：取空白花生样品，分别添加1μg/kg、2μg/kg、10μg/kg三个不同浓度水平的混合标准溶液ⅰ，分别添加0.25μg/kg、0.5μg/kg、2.5μg/kg三个不同浓度水平的混合标准溶液ⅱ，按步骤(3)和(4)检测条件测定，每个水平重复测定6次，计算其回收率和相对标准偏差(rsd)，15种目标化合物的回收率为79.4％～119.8％，rsd为4.16～10.23％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用高效液相色谱－四级杆－静电场轨道阱高分辨质谱，成功实现了花生中4种黄曲霉毒素和11种农药残留同时快速定性和定量分析。高分辨质谱保证了复杂样品中基质干扰的消除，显著提高了目标物定性和定量结果的准确性。该检测方法快速、灵敏、准确，重现性好，可满足花生中真菌毒素和农药残留的日常检测需求，适合大批量样品的快速检测。

附图说明

图1为本发明混合标准溶液ⅰ和混合标准溶液ⅱ提取离子流色谱图，

图2为标准溶液中黄曲霉毒素b1和毒死蜱的提取离子流色谱图，

图3为阳性样品中黄曲霉毒素b1和毒死蜱的提取离子流色谱图，

图4为标准溶液中黄曲霉毒素b1的二级质谱图，

图5为阳性样品中黄曲霉毒素b1的二级质谱图，

图6为标准溶液中毒死蜱的二级质谱图，

图7为阳性样品中毒死蜱的二级质谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例

1仪器与试剂

四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪q－exactive(thermofisherscientific公司)；ultimate3000快速液相色谱仪(thermofisherscientific公司)；3k15离心机(德国sigma公司)；dl-5c低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；oa-sys氮吹仪(美国organomation公司)；milli-q超纯水纯化系统(美国millipore公司)，涡旋混合器(德国ika公司)；milli-q超纯水(美国millipore公司)；0.2μmptfe膜针头过滤器(pall公司)。

黄曲霉毒素b1(afb1)、黄曲霉毒素b2(afb2)、黄曲霉毒素g1(afg1)、黄曲霉毒素g2(afg2)标准溶液(浓度为0.5～2μg/ml，trilogy公司)；啶虫眯、乙草胺、多菌灵、克百威、毒死蜱、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、吡虫啉、嘧霉胺、戊唑醇、噻虫嗪(农业部环境保护科学监测所，1000mg/l)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国merck公司)；甲酸(hplc级，美国sigma公司)；乙酸(色谱纯，天津科密欧公司)；无水硫酸镁、无水乙酸钠(优级纯，天津科密欧公司)；psa填料(40μm，美国agilent公司)；c18硅胶(40μm，美国agilent公司)。

2花生样品前处理

样品(38份花生)经粉碎(过20目筛)混匀后，准确称取2.00g样品置于聚丙烯具塞离心管中，加入10ml乙酸-乙腈-水(1:84:15，v/v/v)提取液，涡旋混匀1min，加入1.0g硫酸镁、0.3g无水乙酸钠后，立即振摇1min，4℃下以5000r/min离心5min使固液分离。转移上清液加入1.0g硫酸镁、100mgpsa与400mgc18硅胶混合体系进行分散固相萃取净化，涡旋振荡1min，然后于5000r/min离心5min，取5ml上清液于40℃水浴中氮吹至干，加入甲醇-水溶液(50：50，v/v)定容至1ml，充分混匀后，过0.22μm滤膜，进样分析。

3仪器检测

3.1仪器检测条件

ultimate3000快速液相色谱仪(thermofisherscientific公司)，thermohypersilgoldc18柱(100mm×2.1mm，1.9μm)；柱温40℃；进样量10μl，流动相:a为含0.1％(体积分数)的甲酸的水溶液，b为甲醇，流速:0.35ml/min，梯度洗脱条件:0～0.8min，2％b；0.8～3min，2％～24％b；3～4min，24％b；4～6min，24％～95％b；6～9min，95％b；9～9.5min，95％～2％b；9.5～12min，2％b。

四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪q－exactive(thermofisherscientific公司)，加热电喷雾离子源(hesi)温度为350℃；毛细管电压为3.5kv；离子传输管温度为320℃；鞘气流速为40unit，辅助气流速为10unit，fullms/dd-ms²扫描模式:采集范围为100～600m/z，正离子采集；一级质谱分辨率为70000fwhm，二级质谱分辨率为17500fwhm；归一化碰撞能量(nce)为30ev、45ev、60ev。

3.2色谱条件的优化

3.2.1流动相的优化

本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸0.1％(v/v)水溶液分别作为流动相，对4种黄曲霉毒素和11种农药残留质谱响应的影响，结果显示，当以乙腈-水为流动相时，毒死蜱的响应明显偏低，在hesi+电离模式下，加入甲酸提高了正离子目标物的离子化效率，灵敏度和响应值进一步得到提高。因此，最终选取甲醇-甲酸0.1％(v/v)水溶液作为流动相，通过优化梯度洗脱程序，目标待测物得到了最佳分离。得到4种黄曲霉毒素和11种农药残留混合标准溶液的提取离子流色谱图。

3.2.2质谱条件优化

黄曲霉毒素和农药残留在正离子扫描过程中均形成加氢准分子离子峰进而在碰撞时碎裂生成子离子，其中黄曲霉毒素在负离子扫描过程中也会失去质子产生[m—h]^－的分子离子，但响应值比正模式低，因此采用正离子扫描模式进行检测。首先在分辨率(r)为70000下对15种目标物进行一级质谱全扫描，将理论精确质量数与实际测量质量数的误差控制在5ppm(10－6)范围内，当母离子强度达到设定阈值(1×106)时，自动触发二级质谱扫描，同时得到母离子的精确质量数以及二级质谱的全扫描信息。检测得到4种黄曲霉毒素和11种农药残留的质谱参数见表1。

表14种黄曲霉毒素和11种农药残留的质谱参数

3.2.3基质效应

考虑到样品中会存在一定的基质效应，本实验对花生样品中的4种黄曲霉毒素和11种农残的基质效应进行了考察，并以目标物在空白基质液中的峰面积与溶剂中峰面积的百分比来评估基质效应，当结果接近100％时，表明无明显的基质效应，而高于100％说明有基质增强效应，低于100％则说明有基质抑制效应。结果显示，15种目标待测物的基质效应在60.1％～131.3％之间，说明这几种目标检测物在花生基质中存在一定的基质增强或抑制效应，其中黄曲霉毒素g1的基质增强效应较强，吡虫啉、噻虫胺基质抑制效应较强。为保证方法的准确度，本实验采用基质匹配标准溶液校正方法进行定量分析和计算。

4绘制标准曲线

采用空白的花生基质溶液，准确配制浓度为1μg/l、2μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l的黄曲霉毒素b1(afb1)、黄曲霉毒素g1(afg1)、啶虫眯、乙草胺、多菌灵、克百威、毒死蜱、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、吡虫啉、嘧霉胺、戊唑醇、噻虫嗪的系列混合标准溶液ⅰ和浓度为0.25μg/l、0.5μg/l、1.25μg/l、2.5μg/l、5.0μg/l的黄曲霉毒素b2和黄曲霉毒素g2的系列混合标准溶液ⅱ，经高分辨质谱检测，以色谱峰面积(y)为纵坐标，对照溶液的质量浓度(x，μg/l)为横坐标绘制标准曲线。高分辨质谱使用目标物的精确质量数提取，基线噪音很低，信噪比往往无穷大，因此我们不采用以3倍信噪比(s/n)确定化合物的检出限(lod)、10倍信噪比确定化合物的定量限(loq)的方法，而是用向空白样品中逐级降低加标浓度，以各目标物在线性范围中满足回收率值在60％～120％区间内的最低浓度为方法的定量限(1imitofquantitation，loq)。结果表明，4种黄曲霉毒素和11种农残在相应浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)均≥0.996，定量限0.25～20μg/l，可满足检测要求。4种黄曲霉毒素和11种农药残留的线性范围、线性方程、相关系数(r2)和定量限见表2。

表24种黄曲霉毒素和11种农药残留的线性范围、线性方程、相关系数(r2)和定量限

5回收率和精密度方法学实验：取空白花生样品，分别添加1μg/kg、2μg/kg、10μg/kg三个不同浓度水平的混合标准溶液ⅰ，分别添加0.25μg/kg、0.5μg/kg、2.5μg/kg三个不同浓度水平的混合标准溶液ⅱ，按3仪器检测条件测定，每个水平重复测定6次，计算其回收率和相对标准偏差(rsd)，15种目标化合物的回收率为79.40％～119.8％，rsd为4.16～10.23％。4种黄曲霉毒素和11种农药残留的加标回收率和相对标准偏差见表3。

表34种黄曲霉毒素和11种农药残留的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)

6最终结果分析

38份花生样品，5份样品检出黄曲霉毒素b1，含量为8.14～213.06μg/kg，12份样品检出毒死蜱，含量为15.38～50.03μg/kg。以一份同时检出黄曲霉毒素b1和毒死蜱的花生样品为例，提取离子流色谱图和二级质谱图，通过与标准溶液的谱图比较定性目标待测物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。