本发明属于生物医药领域。
背景技术：
在现代生物医药领域，对于细胞表面标志、细胞内抗原物质、细胞受体、肿瘤细胞的dna、rna含量以及免疫细胞的功能等信息需要进行分析测量。
现有技术中，除手动进行细胞分布分析的方法外，对细胞实现分布分析的设备一般采用流式细胞仪。流式细胞仪可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围分析出指定的细胞亚群分布情况。
但是，一方面，流式细胞仪在进行细胞分布分析时存在误差大、耗时长等技术缺陷。另一方面，流式细胞仪的价格昂贵且使用成本高，采用该装置进行医学检测的成本高，从而增加了人们的实验和生活成本。人们希望有一种可以快速、高效、误差小的细胞种类的分布分析方法。
技术实现要素：
本发明公开了一种细胞分布分析方法，采用方法对细胞进行分布分析，误差小，精度高，耗时短，成本低。
本发明公开的细胞分布分析方法，包括如下步骤：
提供细胞分布分析装置，所述细胞分布分析装置包括微流控芯片；所述微流控芯片包括衬底，衬底上具有细胞微槽阵列，其包括m列、n行个细胞微槽，每个细胞微槽体积为0.1-10nl；其中，所述细胞微槽阵列为亲水性；所述衬底为柔性材料；
提供细胞悬浮液；
将细胞悬浮液染色；
将染色后的细胞悬浮液均匀的铺到所述细胞分布分析装置上的细胞微槽阵列中；
将细胞均匀的分布在每个细胞微槽中；
用显微镜扫描微流控芯片，进行细胞种类统计，得到每种细胞的分布数据。
其中，将染色后的细胞悬浮液均匀的铺到所述细胞分布分析装置上的细胞微槽阵列中的方法为：用移液枪将染色后的细胞悬浮液均匀的铺到细胞分布分析装置上。
其中，使细胞均匀的分布在每个细胞微槽中的方法包括：在均匀铺有细胞悬浮液的细胞分布分析装置表面上加载平板状压具，对其加压，使得细胞均匀的分布在每个细胞微槽中。
其中，细胞染色方法为荧光染色。
其中，扫描该微流控芯片的细胞微槽阵列的方法包括：将微流控芯片置于荧光显微镜下扫描。
其中，平板状压具包括载玻片。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更清楚的理解本发明的细胞分布分析方法，下面通过具体实施方式进行详细说明。
本发明公开的细胞分布分析方法，包括如下步骤：
首先，提供细胞分布分析装置，所述细胞分布分析装置包括微流控芯片；所述微流控芯片包括衬底，衬底上具有细胞微槽阵列，其包括m列、n行个细胞微槽，m>100，n>100，微槽体积为0.1-10nl；其中，所述细胞微槽阵列为亲水性；所述衬底为柔性材料。
具体地，所述微流控芯片的制造方法包括如下步骤：首先在模型衬底上制作出模型微槽阵列，其中模型微槽的体积为0.1-10nl。其中，模型衬底优选为硅衬底，从而在硅衬底上制造微槽阵列。例如在2.5cmx7.5cm的硅片上可以制作10万个以上的模型微槽。该模型微槽用于将该微槽阵列转移至柔性材料的衬底上以形成微流控芯片。然后，利用注模方式把模型微槽阵列的图案转移到柔性衬底上以形成微流控芯片。其中柔性衬底的材料优选为pdms(聚二甲基硅氧烷)或pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)。通过先在硅衬底上形成微槽然后将微槽图案转移至柔性衬底的方法，可以快速地形成高质量的微槽阵列。最后，对微流控芯片表面进行亲水处理。其中，先对微流控芯片进行等离子处理，然后将其浸泡在亲水性处理溶液中，最后吹干即可得到用于本发明的细胞分布分析装置的微流控芯片。
其次，提供细胞悬浮液；随后，将细胞悬浮液染色；
本发明采用的染色方法优选为荧光染色法。免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光每种需要检测的特定细胞会有特异性。每一个芯片上可以辨别四种荧光颜色，因此每个芯片可以进行四种细胞的分布情况分析。将所需数量的细胞分装进试管中。
具体的，在一个实施例中，对细胞染色的方法包括如下步骤：
步骤1、在稀释的一抗中重悬细胞。
步骤2、在室温下(固定细胞)孵育细胞或在冰上(活细胞)孵育细胞。
步骤3、通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤；丢弃上清液；重复该步骤；
如果使用直接标记的抗体，则直接进行步骤7。
步骤4、在稀释的荧光染料标记的二抗(按建议的稀释度在孵育缓冲液中配制)中重悬细胞。
步骤5、在室温下(固定细胞)或在冰上(活细胞)孵育细胞。
步骤6、通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤；丢弃上清液；重复该步骤。
步骤7、把细胞调整到适合微流控芯片中细胞微槽体积的浓度。比如针对1nl的微槽，细胞浓度1x105个/ul。
在一个具体实施例中，对细胞染色的方法包括如下步骤：
步骤1、在100μl稀释一抗中重悬细胞。
步骤2、在室温下(固定细胞)孵育1小时或在冰上(活细胞)孵育15-30分钟。
步骤3、通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。如果使用直接标记的抗体，则跳到步骤7。
步骤4、在100μl稀释的荧光染料标记的二抗(按建议的稀释度在孵育缓冲液中配制)中重悬细胞。
步骤5、在室温下(固定细胞)或在冰上(活细胞)孵育30分钟。
步骤6、通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
步骤7、在1xpbs中重悬细胞把细胞调整到适合微流控芯片上细胞微槽的浓度，比如针对1nl的微槽，细胞浓度1x105个/ul。
然后，将染色后的细胞悬浮液均匀的铺到所述细胞分布分析装置上的细胞微槽阵列中；
由于细胞微槽的体积在0.1-10nl，每个芯片上制作有3-10万个尺寸一样的细胞微槽。不同的微槽体积对应最佳的细胞浓度已获得最佳的芯片上单细胞分布。比如针对1nl的细胞微槽，细胞浓度为1x105个/ul。
将染色后的细胞悬浮液均匀的铺到所述细胞分布分析装置上的细胞微槽阵列中的方法为，首先在表面处理过的微流控芯片上用移液枪均匀地铺上细胞悬浮液，然后用载玻片与微流控芯片通过夹具压在一起使单细胞均匀地分布在微槽阵列中。
如此，即可将细胞将均匀的分布在每个细胞微槽中。
最后，用显微镜扫描微流控芯片，进行细胞种类统计，得到每种细胞的分布数据。
把铺好细胞的微流控芯片在全自动荧光显微镜下扫描，这样每个微槽内的细胞都被记录下来，然后把每种细胞的分布情况统计出来。
如上所述，基于细胞微槽阵列微流控芯片的细胞分类统计不需要大型贵重设备和专业的技术人员，方法简单直接，通量高，成本低，准确率高，耗时短，比传统的流式细胞仪方法具有诸多优点。
本发明的细胞分布分析装置可以用于：干细胞组织工程再研究；细胞增值、活性和凋亡研究；疾病细胞如炎症细胞、肿瘤细胞等的发生、发展和转归研究；基因表达和表达调控研究；细胞内信号传导和生物大分子间相互作用研究；各种病原体如病毒、细菌等基础和致病性和致病机理研究；药理药效和药物开发研究；移植和细胞治疗研究；生物材料对细胞结构、活性和功能的影响等。