一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取的方法与流程

本发明涉及植物根系细胞质膜蛋白提取领域，具体地说是一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取的方法。

背景技术：

细胞质膜存在于细胞表面，主要由膜脂和膜蛋白组成，维护细胞内微环境的相对稳定，参与细胞内与外界环境的物质交换，能量和信息的传递，在细胞的生长和分化中起重要作用，是生物膜功能的主要承担者。盐生植物盐生草（halogetonglomeratus）具有极强的耐盐性，其根系对na⁺呈限制性吸收的特性，但是目前盐生草根系对na⁺的限制性吸收机理仍不明确，分离盐生草根系的质膜蛋白对于研究盐生草根系的耐盐机制，挖掘耐盐基因具有重要意义。当前并没有任何关于盐生草根系质膜蛋白提取方法的报道及可实施的操作方法。因此，提供一种简便、可操作的盐生草根系质膜蛋白的提取方法是具有重要的现实意义。

现有技术存在的问题：现有技术在分离细胞质膜蛋白的过程中，对样品造成的污染较多，损失较大，且分离过程复杂，质膜蛋白获得率较低。盐生草为须根系根系不发达，细胞质膜蛋白含量低，相比其他植物细胞质膜蛋白提取更困难。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取的方法，以盐生草根系为材料，通过密度梯度离心、两相分离技术及超高速离心获得理想的盐生草根系质膜蛋白。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取的方法，包括如下步骤：

（1）盐生草根系的采集

将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至1-2个月，采集其根系。

（2）根系匀浆液的获得

将步骤（1）采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（根系：匀浆研磨液=1：1），至根系研磨为液体状。

（3）根系研磨液的离心分离

将步骤（2）获得的根系研磨液置于超高速离心机，在26000-30000g，4℃条件下离心25-30min，取上清液，弃沉淀。

（4）上清液进一步离心分离

将步骤（3）获得的上清液置于超高速离心机，在84000-90000g，4℃条件下离心25-30min，取沉淀，弃上清液。

（5）沉淀进行悬浮

将悬浮液加入步骤（4）获得的沉淀中，至沉淀完全溶解。

（6）两相分离

将步骤（5）获得的悬浮液置于两相分离液中（悬浮液：分离液=1：2），并置于超高速离心机，在2000-2500g，4℃条件下离心10-15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次。

（7）上相进行离心分离

将步骤（6）获得的上相置于超高速离心机，在85000-90000g，4℃条件下离心30-35min，取沉淀。

（8）质膜蛋白的保存

将步骤（7）获得的沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，最后-80℃保存。

（9）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

对步骤（8）获得的蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

优选的，步骤（2）中所述的匀浆研磨液为：50-55mmtriz，500-550mm蔗糖，10-13%甘油（w/v），20-25mmedta-na2，20-25mmegta，50-60mmnaf，5-6mmβ-glycerophosphate，1-2mmphenantroline，0.6-0.8%pvp（w/v），10-13mm抗坏血酸，ph值为7.0-8.0。

优选的，步骤（3）和步骤（4）中所述的离心管为超高速离心管，且取上清液时，应取靠近管口位置1/2-2/3的上清液，将离心管底部1/3-1/2的液体随沉淀一并舍弃。

优选的，步骤（5）中所述的悬浮液为5-7mm磷酸缓冲溶液，330-350mm蔗糖，2-3mmdtt，10-13mmnaf，ph值为7.0-8.0。

优选的，步骤（6）中所述的两相分离液为6.4-6.6%dextrant-500（w/w），6.4-6.6%peg-3350，5-7mm磷酸缓冲溶液，5-7mmkcl和300-350mm蔗糖，ph值为7.0-8.0。

优选的，步骤（7）中所述的将上相离心分离完后，应将离心管倒置于滤纸上，迅速将离心管壁的水分吸干。

有益效果：

（1）整个盐生草根系质膜蛋白分离的过程用运了密度梯度离心、两相分离技术及超高速离心的技术，可有效地实现细胞器和细胞膜的分离，并且整个操作过程都在4℃的环境下进行，避免了蛋白降解造成的污染与浪费。实现了简单、易行、高效获得盐生草根系质膜蛋白的目标。

（2）该方法直接以盐生草根系为材料，提取盐生草根系质膜蛋白，得到的质膜蛋白与自身植株根系的特性一致，对研究更具有说服力。

（3）该方法是根据盐生草根系细胞的特点，选择相关的试剂进行质膜蛋白的提取，获得的质膜蛋白含量高，纯度高。

附图说明

图1是本发明根系研磨的匀浆液。

图2是本发明匀浆液的离心。

图3是本发明上清液的离心。

图4是本发明第一次两相分离。

图5是本发明第二次两相分离。

图6是本发明聚丙烯酰胺凝胶电泳。

其中，附图6中m为蛋白质marker，1-3分别对应实施例2-4实验结果。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供了一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取的方法，采用如下步骤：

（1）盐生草根系的采集

将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至1-2个月，采集其根系。

（2）根系匀浆液的获得

将步骤（1）采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（根系：匀浆研磨液=1：1），至根系研磨为液体状。

（3）根系研磨液的离心分离

将步骤（2）获得的根系研磨液置于超高速离心机，在26000-30000g，4℃条件下离心25-30min，取上清液，弃沉淀。

（4）上清液进一步离心分离

将步骤（3）获得的上清液置于超高速离心机，在84000-90000g，4℃条件下离心25-30min，取沉淀，弃上清液。

（5）沉淀进行悬浮

将悬浮液加入步骤（4）获得的沉淀中，至沉淀完全溶解。

（6）两相分离

将步骤（5）获得的悬浮液置于两相分离液中（悬浮液：分离液=1：2），并置于超高速离心机，在2000-2500g，4℃条件下离心10-15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次。

（7）上相进行离心分离

将步骤（6）获得的上相置于超高速离心机，在85000-90000g，4℃条件下离心30-35min，取沉淀。

（8）质膜蛋白的保存

将步骤（7）获得的沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，最后-80℃保存。

（9）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

对步骤（8）获得的蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

进一步地，步骤（2）中所述的匀浆研磨液为：50-55mmtriz，500-550mm蔗糖，10-13%甘油（w/v），20-25mmedta-na2，20-25mmegta，50-60mmnaf，5-6mmβ-glycerophosphate，1-2mmphenantroline，0.6-0.8%pvp（w/v），10-13mm抗坏血酸，ph值为7.0-8.0。

进一步地，步骤（3）和步骤（4）中所述的离心管为超高速离心管，且取上清液时，应取靠近管口位置1/2-2/3的上清液，将离心管底部1/3-1/2的液体随沉淀一并舍弃。

进一步地，步骤（5）中所述的悬浮液为5-7mm磷酸缓冲溶液，330-350mm蔗糖，2-3mmdtt，10-13mmnaf，ph值为7.0-8.0。

进一步地，步骤（6）中所述的两相分离液为6.4-6.6%dextrant-500（w/w），6.4-6.6%peg-3350，5-7mm磷酸缓冲溶液，5-7mmkcl和300-350mm蔗糖，ph值为7.0-8.0。

进一步地，步骤（7）中所述的将上相离心分离完后，应将离心管倒置于滤纸上，迅速将离心管壁的水分吸干。

实施例2

本实施例提供了一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取方法中的参数选择，具体如下：

将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至1个月，采集其根系，将采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（52mmtriz，500mm蔗糖，12%甘油（w/v），25mmedta-na2，22mmegta，55mmnaf，5mmβ-glycerophosphate，1mmphenantroline，0.8%pvp（w/v），10mm抗坏血酸，ph值为7.0），至根系研磨为液体状，接着将匀浆液置于超高速离心机，在28000g，4℃条件下离心30min，取上清液，弃沉淀，将获得的上清液置于超高速离心机，在85000g，4℃条件下离心25min，取沉淀，弃上清液，然后将悬浮液（5mm磷酸缓冲溶液，350mm蔗糖，2mmdtt，13mmnaf，ph值为8.0）加入获得的沉淀中，至沉淀完全溶解，然后将悬浮液置于两相分离液中（6.4%dextrant-500，6.5%peg-3350，7mm磷酸缓冲溶液，5mmkcl和350mm蔗糖，ph值为8.0），并置于超高速离心机，在2000g，4℃条件下离心15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次，最后将上相置于超高速离心机，在90000g，4℃条件下离心35min，取沉淀，将沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，-80℃保存。最后对蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

结果：如附图6第1泳道所示，蛋白质胶图完整性好，重复性好，峰度高，符合后续实验需求。

实施例3

本实施例提供了一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取方法中的参数选择，具体如下：

将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至2个月，采集其根系，将采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（50mmtriz，520mm蔗糖，10%甘油（w/v），23mmedta-na2，25mmegta，60mmnaf，5mmβ-glycerophosphate，1mmphenantroline，0.6%pvp（w/v），13mm抗坏血酸，ph值为7.0），至根系研磨为液体状，接着将匀浆液置于超高速离心机，在26000g，4℃条件下离心25min，取上清液，弃沉淀，将获得的上清液置于超高速离心机，在84000g，4℃条件下离心30min，取沉淀，弃上清液，然后将悬浮液（6mm磷酸缓冲溶液，300mm蔗糖，3mmdtt，10mmnaf，ph值为8.0）加入获得的沉淀中，至沉淀完全溶解，然后将悬浮液置于两相分离液中（6.5%dextrant-500，6.5%peg-3350，5mm磷酸缓冲溶液，5mmkcl和350mm蔗糖，ph值为7.5），并置于超高速离心机，在2500g，4℃条件下离心15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次，最后将上相置于超高速离心机，在85000g，4℃条件下离心30min，取沉淀，将沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，-80℃保存。最后对蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

结果：如附图6第2泳道所示，胶图完整性好，重复性好，峰度高，符合后续实验需求。

实施例4

本实施例提供了一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取方法中的参数选择，具体如下：

将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至2个月，采集其根系，将采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（54mmtriz，500mm蔗糖，13%甘油（w/v），23mmedta-na2，21mmegta，55mmnaf，6mmβ-glycerophosphate，1mmphenantroline，0.7%pvp（w/v），13mm抗坏血酸，ph值为7.5)，至根系研磨为液体状，接着将匀浆液置于超高速离心机，在30000g，4℃条件下离心30min，取上清液，弃沉淀，将获得的上清液置于超高速离心机，在84000g，4℃条件下离心26min，取沉淀，弃上清液，然后将悬浮液（7mm磷酸缓冲溶液，350mm蔗糖，2.5mmdtt，12mmnaf，ph值为7.5）加入获得的沉淀中，至沉淀完全溶解，然后将悬浮液置于两相分离液中（6.4%dextrant-500，6.6%peg-3350，6mm磷酸缓冲溶液，6mmkcl和300mm蔗糖，ph值为8.0），并置于超高速离心机，在2500g，4℃条件下离心15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次，最后将上相置于超高速离心机，在86000g，4℃条件下离心30min，取沉淀，将沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，-80℃保存。最后对蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

结果：如附图6第3泳道所示，胶图完整性好，重复性好，峰度高，符合后续实验需求。

实施例5

本实施例提供了一种盐生草根系细胞质膜蛋白提取方法中的参数选择，具体如下：

在分离和纯化盐生草根系质膜蛋白的过程中，所用的两相分离的试剂药品及其用量，离心率及离心时间起到了关键作用，本试验通过对上述四种关键因素进行优化，确定了最佳的盐生草根系细胞质膜蛋白提取的方法。

（1）两相分离所需的最佳试剂药品的选择

选择常用的两相分离试剂6.5%dextrant-500，6.5%peg-3350和5mmkcl和300mm蔗糖为所需的药品试剂，设置六个处理，分别为处理a（6.5%dextrant-500+6.5%peg-3350+5mmkcl+300mm蔗糖），处理b（6.5%dextrant-500+6.5%peg-3350+5mmkcl），处理c（6.5%peg-3350+5mmkcl+300mm蔗糖），处理d（6.5%dextrant-500+6.5%peg-3350），处理e（6.5%dextrant-500+6.5%peg-3350+300mm蔗糖），处理f（5mmkcl+300mm蔗糖）。将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至2个月，采集其根系，将采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（54mmtriz，500mm蔗糖，13%甘油（w/v），23mmedta-na2，21mmegta，55mmnaf，6mmβ-glycerophosphate，1mmphenantroline，0.7%pvp（w/v），13mm抗坏血酸，ph值为7.5)，至根系研磨为液体状，接着将匀浆液置于超高速离心机，在30000g，4℃条件下离心30min，取上清液，弃沉淀，将获得的上清液置于超高速离心机，在84000g，4℃条件下离心26min，取沉淀，弃上清液，然后将悬浮液（7mm磷酸缓冲溶液，350mm蔗糖，2.5mmdtt，12mmnaf，ph值为7.5）加入获得的沉淀中，至沉淀完全溶解，然后将悬浮液置于上述六种不同的两相分离液中，并置于超高速离心机，在2500g，4℃条件下离心15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次，最后将上相置于超高速离心机，在86000g，4℃条件下离心30min，取沉淀，将沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，-80℃保存。最后对蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，处理a胶图完整性好，重复性好，峰度高，符合后续实验需求。处理b和处理c胶图完整性差，重复性差，峰度低，达不到后续实验需求。

（2）最佳药品用量的选择

通过试验例1筛选出最佳两相分离所需药品的基础上，继续对两相分离药品dextrant-500和peg-3350的用量进行选择，设置三个处理，分别为：处理a（3%dextrant-500+6%peg-3350），处理b（6%dextrant-500+6%peg-3350），处理c（10%dextrant-500+6%peg-3350）。将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至2个月，采集其根系，将采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（54mmtriz，500mm蔗糖，13%甘油（w/v），23mmedta-na2，21mmegta，55mmnaf，6mmβ-glycerophosphate，1mmphenantroline，0.7%pvp（w/v），13mm抗坏血酸，ph值为7.5)，至根系研磨为液体状，接着将匀浆液置于超高速离心机，在30000g，4℃条件下离心30min，取上清液，弃沉淀，将获得的上清液置于超高速离心机，在84000g，4℃条件下离心26min，取沉淀，弃上清液，然后将悬浮液（7mm磷酸缓冲溶液，350mm蔗糖，2.5mmdtt，12mmnaf，ph值为7.5）加入获得的沉淀中，至沉淀完全溶解，然后将悬浮液置于上述六种不同的两相分离液中，并置于超高速离心机，在2500g，4℃条件下离心15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次，最后将上相置于超高速离心机，在86000g，4℃条件下离心30min，取沉淀，将沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，-80℃保存。最后对蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，处理b胶图完整性好，重复性好，峰度高，符合后续实验需求。处理a和处理c胶图完整性差，重复性差，峰度低，达不到后续实验需求。

（3）两相分离所需离心率的选择

通过试验1和试验2筛选出的最佳两相分离液及其用量的基础上，进一步对离心时间也进行了优化，设置三个处理，分别为处理a：1000g，处理b：2500g，处理c：4000g。将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至2个月，采集其根系，将采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（50mmtriz，500mm蔗糖，13%甘油（w/v），25mmedta-na2，25mmegta，50mmnaf，5mmβ-glycerophosphate，1mmphenantroline，0.6%pvp（w/v），13mm抗坏血酸，ph值为7.6)，至根系研磨为液体状，接着将匀浆液置于超高速离心机，在30000g，4℃条件下离心30min，取上清液，弃沉淀，将获得的上清液置于超高速离心机，在84000g，4℃条件下离心26min，取沉淀，弃上清液，然后将悬浮液（6mm磷酸缓冲溶液，300mm蔗糖，2.5mmdtt，10mmnaf，ph值为7.8）加入获得的沉淀中，至沉淀完全溶解，然后将悬浮液置于两相分离液中，并置于超高速离心机，离心率为上述三种不同的离心率，4℃条件下离心15min，取上相，弃下相，并重复该步骤2次，最后将上相置于超高速离心机，在85000g，4℃条件下离心30min，取沉淀，将沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，-80℃保存。最后对蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，处理b胶图完整性好，重复性好，峰度高，符合后续实验需求。处理a和处理c胶图完整性差，重复性差，峰度低，达不到后续实验需求。

（4）两相分离所需离时间的选择

通过试验1、试验2和试验3的基础上，进一步对离心时间进行优化，设置三个处理，分别为处理a：5min，处理b：15min，处理c：25min。通过试验1和试验2筛选出的最佳两相分离液及其用量的基础上，进一步对离心时间也进行了优化，设置三个处理，分别为处理a：1000g，处理b：2500g，处理c：4000g。将盐生草种子置于花盆中进行培养，待幼苗长至2个月，采集其根系，将采集的根系置于研钵，并加入匀浆研磨液（50mmtriz，500mm蔗糖，13%甘油（w/v），25mmedta-na2，25mmegta，50mmnaf，5mmβ-glycerophosphate，1mmphenantroline，0.6%pvp（w/v），13mm抗坏血酸，ph值为7.6)，至根系研磨为液体状，接着将匀浆液置于超高速离心机，在30000g，4℃条件下离心30min，取上清液，弃沉淀，将获得的上清液置于超高速离心机，在84000g，4℃条件下离心26min，取沉淀，弃上清液，然后将悬浮液（6mm磷酸缓冲溶液，300mm蔗糖，2.5mmdtt，10mmnaf，ph值为7.8）加入获得的沉淀中，至沉淀完全溶解，然后将悬浮液置于两相分离液中，并置于超高速离心机，离心率2500g，4℃离心，离心时间为上述三种不同的离心时间。取上相，弃下相，并重复该步骤2次，最后将上相置于超高速离心机，在85000g，4℃条件下离心30min，取沉淀，将沉淀液氮冷冻，并真空冷冻干燥，-80℃保存。最后对蛋白质进行进一步的纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测。

结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，处理b胶图完整性好，重复性好，峰度高，符合后续实验需求。处理a和处理c胶图完整性差，重复性差，峰度低，达不到后续实验需求。

综上所述，故确定质膜蛋白提取过程中，最佳两相分离的试剂药品及其用量为6.4-6.6%dextrant-500+6.4-6.6%peg-3350+5-7mmkcl和300-350mm蔗糖，最佳的离心率为2000-2500g，最佳的离心时间为10-15min。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。