一种采用聚冠醚功能化纳米纤维在线前处理尿液样品的检测方法与流程

本发明涉及尿液样品分析前处理材料技术领域，涉及一种根据吸附原理设计的可以选择性吸附儿茶酚胺类神经递质的聚冠醚功能化纳米纤维材料装填的在线固相萃取柱用于在线样品前处理及检测应用。

背景技术：

儿茶酚胺类神经递质主要包括肾上腺素（e)，去甲肾上腺素(ne)和多巴胺(da)，是生物体内重要的单胺类神经递质，在体内调节基本生理功能，传递生理信号，是正常生理过程中重要的信号介质。同时在病理过程中也出现其含量的相应变化。因此，检测生物体液中的儿茶酚胺类神经递质对于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、高血压、心肌梗塞、肾上腺髓质增生等疾病的临床诊断具有重要意义，并且有助于甲亢、甲减、充血性心衰、糖尿病、肾功能不全、低血糖症等疾病的诊断，对神经电生理等基础医学研究也具有重要意义。目前常用的儿茶酚胺类神经递质检测方法以高效液相色谱法电化学检测器或荧光检测器为主。由于人体体液中此类物质含量极低，且所采集的生物样品中其它内源性物质常常干扰测定，使得生物样品中的儿茶酚胺类神经递质直接检测往往达不到理想的检测灵敏度，不能满足准确分析的需要。在我们前期的研究中发现，某些具有特定冠醚功能基团的纳米纤维，用于儿茶酚胺样本的吸附效果明显，已成功用于离线样品前处理及检测应用。但是离线样品前处理耗时费力且易造成损耗误差，而在线样品前处理与高效液相色谱检测方法联用不仅可以减轻技术人员的劳动强度，实现分析自动化，节约分析成本；更主要的是可以减少甚至消除由手工操作中个体差异所产生的误差，提高分析测试的灵敏度、准确度与重现性。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题是基于一种聚冠醚功能化纳米纤维的在线固相萃取柱的装填技术，能够组装出可以在线富集净化尿液样品中儿茶酚胺类物质的在线前处理与检测体系，用于选择性吸附目标物、去除基质杂质，确保目标物检测的准确度和精密度。实现自动化一体化样品前处理与检测，节省人力和物力，降低检测误差，实现高通量样品检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

一种采用聚冠醚功能化纳米纤维在线前处理尿液样品的检测方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）在线固相萃取柱的装填：聚冠醚功能化纳米纤维的在线固相萃取柱（10mm×4.6mm），c18分析柱（4.0×100mm，3μm），十通切换阀，双三元泵，自动进样器，荧光检测器组成。

采用10mm×4.6mm两端开口可拆卸的不锈钢柱管作为在线固相萃取柱，装填方法如下：取聚冠醚功能化纳米纤维适量，分次装填于一端用筛板封口的柱管底端，以直径为0.5mm的不锈钢细棒压实，另一端也用筛板封口，装入外套中，接入高效液相色谱系统待用；所述的聚冠醚功能化纳米纤维指的是已申请的中国发明专利中所保护的纳米纤维材料（国家发明专利申请号：2017108335670；一种聚冠醚功能化纳米纤维材料制备方法及在尿液儿茶酚胺检测中的应用）；

（2）尿液样本处理：尿液经0.22μm的水膜过滤后，取200μl，加入到200μlph7.8的磷酸盐缓冲液混匀，再加入50μl二苯硼酸2-氨基乙基酯和50μlis（3,4-二羟基苯乙胺氢溴酸，1μg/ml）后再次混匀，待进样富集净化分析；

（3）在线固相萃取及检测分析：

分取待萃取的尿液处理后溶液适量至2ml进样瓶中，运行色谱程序，进样100μl至在线固相萃取柱中，超纯水作为左路泵流动相，富集净化时间为3分钟，切换阀路，在线固相萃取柱与右路泵相连，洗脱液流路过来将吸附在在线固相萃取柱上的目标物洗脱并转移至分析柱上，阀路再次切换回原始状态，此时左路泵重新活化在线固相萃取柱以备再次进样处理，右路泵接入流动相进行分离检测；所述的洗脱液指的是1mol/l乙酸溶液。

本发明进一步公开了所述采用聚冠醚功能化纳米纤维在线前处理尿液样品检测方法在准确检测儿茶酚胺类物质：去甲肾上腺素ne；肾上腺素e；3,4-二羟基苯乙胺氢溴酸is；多巴胺da方面的应用。实验结果证明：

（1）聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱对尿液儿茶酚胺的加标回收率在95%左右，精密度小于3%（n=9），有利于复杂样品中目标物质的准确测定；

（2）在进样量为100微升的条件下，聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱对儿茶酚胺进行富集后的线性范围为1-100ng/ml(500ng/ml的样品检测器信号超标)，三种目标物质的线性相关系数都在0.999左右，可满足实际样本的检测分析。此外，此在线富集净化体系能有效去除复杂基质中内源性杂质的影响，更能保证目标物质的准确测定。

本发明所采用的聚冠醚功能化纳米纤维材料的制备见中国发明专利（国家发明专利申请号：2017108335670；一种聚冠醚功能化纳米纤维材料制备方法及在尿液儿茶酚胺检测中的应用）。

本发明更加详细的描述如下：

（1）制备聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱：

在线固相萃取柱的装填：聚冠醚功能化纳米纤维的在线固相萃取柱（10mm×4.6mm），c18分析柱（4.0×100mm，3μm），十通切换阀，双三元泵，自动进样器，荧光检测器组成。取空心的固相萃取柱，打开一端的滤芯盖，再取聚冠醚功能化纳米纤维适量装填于萃取柱中，用器件撸实。盖上滤芯盖后，安装于不锈钢的柱管外套中，制成聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱。

（2）将步骤（1）中的聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱接入双三元高效液相色谱仪左路泵流路中，左路泵前端接入自动进样器，中间接聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱，后端接入废液收集瓶。右路泵通过十通切换阀接入分析柱和荧光检测器。

（3）利用步骤（2）中搭建好的分析通路，左路泵流路实现样品进样富集与除杂净化。右路泵流路进行分析柱平衡，做好分析样品的准备。当左路泵中的样品目标物富集完毕，进行十通阀的切换。切换后聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱接入右路泵流路中，右路泵流路中的洗脱剂将富集在聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱中的目标物转移至分析柱中进行分析。转移完毕，十通阀继续切换至最初状态，此时，左路泵进行甲醇与水体系对聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱的再次活化平衡，而右路泵则开始样品分离检测。分析结束，可重新进行下一针样品的富集净化分析。

本发明所述的聚冠醚功能化纳米纤维主要包括：

4-硝基苯并-18-冠-6醚聚苯乙烯复合纳米纤维、2-氨基甲基-18-冠-6聚丙烯腈复合纳米纤维、环己烷-18-冠-6聚苯乙烯复合纳米纤维、4'-乙酰苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、苯并-18-冠-6-醚聚丙烯腈复合纳米纤维、18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、4'-甲酰苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、二苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、反-4,5'-二硝基二苯并-18-冠-6聚苯乙烯复合纳米纤维、4'-异氰酸苯并-18-冠-6聚丙烯腈复合纳米纤维、4',4''(5'')-二乙酰二苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、4-羧基苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、4',4''(5'')-二叔丁基二环己基并-18-冠-6、2-(烯丙氧基甲基)-18-冠-6-醚聚丙烯腈复合纳米纤维；优选4-羧基苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、4-硝基苯并-18-冠-6醚聚苯乙烯复合纳米纤维、二苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维。

在本发明一个较佳实施例中，所述聚冠醚功能化纳米纤维为4-硝基苯并-18-冠-6醚聚苯乙烯复合纳米纤维、2-氨基甲基-18-冠-6聚丙烯腈复合纳米纤维、苯并-18-冠-6-醚聚丙烯腈复合纳米纤维、18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、二苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维、4-羧基苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维。

本发明解决的难点在于：找到合适的可用于纳米纤维装填的在线固相萃取器件，制备在线固相萃取（装填纳米纤维），并设计其与高效液相系统相连接与应用所需要的运行程序。

实验中重点考察了该在线前处理与检测方法的重复性、精密度、加标样品的回收率以及线性范围等方法学方面的指标，以及尿液样本中内源性杂质净化方面的问题。

本发明公开的基于聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明在实验研究中发现离线样品前处理耗时费力，且易造成人员手工操作误差；采用在线样品前处理与高效液相色谱检测方法联用不仅可以减轻技术人员的劳动强度，实现分析自动化，节约分析成本；更主要的是可以减少甚至消除由手工操作中个体差异所产生的误差，提高分析测试的灵敏度、准确度与重现性。

（2）本发明所公开的聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱与现有的纳米纤维萃取柱相比可实现高通量自动化样品前处理与检测，操作简便，省时省力，优势明显。操作误差较小，平行操作的精密度很高，在0.9-2.6%之间。

附图说明

图1在线样品前处理-高效液相色谱在线联用系统；

图2聚冠醚功能化纳米纤维装填的在线固相萃取柱；

图3儿茶酚胺标准溶液（100ng/ml）采用聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取检测色谱图，其中1:ne2:e3:is4:da；

图4尿液样本采用聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取检测色谱图；其中1:ne2:e3:is4:da；

图5尿液样本加标（100ng/ml）采用聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取检测色谱图；其中1:ne2:e3:is4:da。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。在本发明申请文件中所用到的试剂、原料、萃取柱器件（包括柱芯和柱套管）均由市售。

实施例1

一种采用聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系的研究及应用于尿液样品检测中，包括以下步骤:

在线固相萃取柱的装填：聚冠醚功能化纳米纤维的在线固相萃取柱（10mm×4.6mm），c18分析柱（4.0×100mm，3μm），十通切换阀，双三元泵，自动进样器，荧光检测器组成。

（1）制备聚冠醚功能化纳米纤维材料:制备方法见中国发明专利（国家发明专利申请号：2017108335670；一种聚冠醚功能化纳米纤维材料制备方法及在尿液儿茶酚胺检测中的应用）。

（2）将所述聚冠醚功能化纳米纤维材料装填制备成在线固相萃取柱。

（3）将所述聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取柱连接入高效液相系统，组建基于聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系。

聚冠醚功能化纳米纤维材料的应用技术，将上述聚冠醚功能化纳米纤维装填成在线固相萃取柱接入高效液相色谱分离检测体系，以实现在线吸附净化尿液样本中的儿茶酚胺类物质，通过阀路切换，将富集于在线固相萃取柱中的目标物质转移至分析柱进行分离检测。

实施例2

采用聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系的研究及应用于尿液样品检测的方法：

（1）在线固相萃取柱的装填

在线固相萃取柱的装填：聚冠醚功能化纳米纤维的在线固相萃取柱（10mm×4.6mm），c18分析柱（4.0×100mm，3μm），十通切换阀，双三元泵，自动进样器，电化学检测器组成。

本实验采用10mm×4.6mm的不锈钢柱管（两端开口可拆卸）作为在线固相萃取柱。装填方法如下：取所制备的纳米纤维(4-羧基苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维或二苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维)适量，分次装填于柱管底端（一端用筛板封口），以直径为0.5mm的不锈钢细棒压实，另一端也用筛板封口，装入外套中，接入高效液相色谱体系待用。

（2）尿液样本处理：尿液经0.22μm的水膜过滤后，取200μl加入200μlph7.8的磷酸盐缓冲液混匀，加入50μl二苯硼酸2-氨基乙基酯（dpba，儿茶酚胺络合试剂）和50μlis（3,4-二羟基苯乙胺氢溴酸，1μg/ml）后再次混匀，待进样富集净化分析。

（3）在线固相萃取及检测分析

分取待萃取的尿液处理后溶液适量至2ml进样瓶中，运行色谱程序，进样1ml至在线固相萃取柱中，超纯水作为流动相，富集净化时间为4分钟。切换阀路，在线固相萃取柱与右路泵相连，洗脱液流路过来将吸附在在线固相萃取柱上的目标物洗脱并转移至分析柱上，阀路再次切换回原始状态。此时左路泵重新活化在线固相萃取柱以备再次进样处理，右路泵接入流动相进行分离检测。附图1展示的是pfspe-hplc在线联用系统，在线处理尿液样本，效率高，误差小，确保样本分析结果的准确度。

聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系成功的将儿茶酚胺（去甲肾上腺素ne；肾上腺素e；3,4-二羟基苯乙胺氢溴酸is；多巴胺da）进行富集转移并检测，如附图3所示。而实际尿液样本的在线处理与检测的结果如附图4所示，三种目标物和一种内标物质都清晰可见，尿液样本中大量的内源性杂质基本除尽，保证目标物质的准确测定。说明离线处理的实验结果完全能够用在线前处理与检测系统重现出来。

实施例3

采用聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系的研究及应用于尿液样品检测的方法：

（1）在线固相萃取柱的装填

在线固相萃取柱的装填：聚冠醚功能化纳米纤维的在线固相萃取柱（10mm×2.1mm），c18分析柱（4.0×100mm，3μm），十通切换阀，双三元泵，自动进样器，荧光检测器组成。

本实验采用10mm×2.1mm的不锈钢柱管（两端开口可拆卸）作为在线固相萃取柱。装填方法如下：取所制备的纳米纤维(4-羧基苯并-18-冠-6-醚聚苯乙烯复合纳米纤维或4-硝基苯并-18-冠-6醚聚苯乙烯复合纳米纤维)适量，分次装填于柱管底端（一端用筛板封口），以直径为0.5mm的不锈钢细棒压实，另一端也用筛板封口，装入外套中，接入高效液相色谱体系待用。

（2）尿液样本处理：尿液经0.22μm的水膜过滤后，取200μl加入200μlph7.8的磷酸盐缓冲液混匀，加入50μl二苯硼酸2-氨基乙基酯（dpba，儿茶酚胺络合试剂）和50μlis（3,4-二羟基苯乙胺氢溴酸，1μg/ml）后再次混匀，待进样富集净化分析。

（3）在线固相萃取及检测分析

分取待萃取的尿液处理后溶液适量至2ml进样瓶中，运行色谱程序，进样100μl至在线固相萃取柱中，超纯水作为流动相，富集净化时间为3分钟。切换阀路，在线固相萃取柱与右路泵相连，洗脱液流路过来将吸附在在线固相萃取柱上的目标物洗脱并转移至分析柱上，阀路再次切换回原始状态。此时左路泵重新活化在线固相萃取柱以备再次进样处理，右路泵接入流动相进行分离检测。附图1展示的是在线样品前处理-高效液相色谱在线联用系统，在线处理尿液样本，效率高，误差小，确保样本分析结果的准确度。

聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系成功的将儿茶酚胺（去甲肾上腺素ne；肾上腺素e；3,4-二羟基苯乙胺氢溴酸is；多巴胺da）进行富集转移并检测，如附图3所示。而实际尿液样本的在线处理与检测的结果如附图4所示，三种目标物和一种内标物质都清晰可见，尿液样本中大量的内源性杂质基本除尽，保证目标物质的准确测定。说明离线处理的实验结果完全能够用在线前处理与检测系统重现出来。

实施例4

对比实验

将本发明所公开的聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系与文献报道已有的聚冠醚纳米纤维离线固相提取尿液中儿茶酚胺实验相比，结果见附图5和表1。发现文献报道已有的聚冠醚功能化纳米纤维对尿液样本富集净化后的结果较好，同一样本多次平行实验所得到的结果差异很小（2.7%、2.9%、3.7%，n=6）。而本发明所公开的聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系应用于尿液中儿茶酚胺的测定，对同一份加标尿液的9次测试结果表明差异更小（内标法的rsd值分别为0.9%、0.9%、2.6%，n=9）。

与聚冠醚纳米纤维离线固相提取方式相比，本发明所公开的聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的优势是避免不必要的人工操作，省事省力且操作误差更小，方法更适合向不同的检验实验室推广。此外，聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取可以反复循环使用，以最小内径2.1mm的柱子为例，装填10mg的纳米纤维就可以使用约200次，而相同量的纳米纤维用于离线处理方式只能使用3-4次，在线方式使用效率大大提高，也可以降低检测成本。

表1.聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的尿液加标样本（100ng/ml）

已有的聚冠醚纳米纤维离线处理方式（见参考文献liqinchen,etal.journalofchromatography.a,2018，1561：48-55.）；

结论：

（1）聚冠醚功能化纳米纤维在线样品前处理的神经递质检测体系能够实现尿液儿茶酚胺的富集与内源性杂质净化，避免不必要的人工操作，省事省力且操作误差比已有方法更小，方法更适合向不同的检验实验室推广。

（2）聚冠醚功能化纳米纤维在线固相萃取可以多次使用，在线方式使用效率大大提高，也可以降低检测成本。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。