一种HPV抗体快速检测试纸条及其制备方法和使用方法与流程

本发明涉及hpv抗体检测技术领域，特别涉及一种hpv抗体快速检测试纸条及其制备方法和使用方法。

背景技术：

宫颈癌是临床最为常见的妇科肿瘤之一,主要由人乳头状瘤病毒(hpv)感染引发的，其发病率仅次于乳腺癌,居女性恶性肿瘤的第2位。在发展中国家，宫颈癌是女性癌症中死亡率最高的肿瘤。

到目前为止，已报道发现的hpv有120多种，根据其致癌性分为高危型(致癌型)hpv、可能致癌性和低危型hpv，高危型hpv中以hpv16、hpv18、hpv31、hpv33型与宫颈癌的发病关系最为密切，尤其以hpv16、hpv18最为常见。据报道，在宫颈癌中这两种类型的hpv的检出率达70％以上。hpv16型多见于宫颈鳞癌，hpv18型多见于宫颈腺癌，而低危型hpv多在湿疣等良性病变中发现。

hpv基因组编码的10个开放读码框架分别为e1～e8及l1～l2，其中hpvl1为主要衣壳蛋白。hpvl1是hpv病毒入侵细胞前便暴露于机体免疫系统的抗原，相比于其他病毒蛋白更容易被免疫系统识别和清除，是目前研究开发hpv疫苗的主要靶向抗原。

随着hpv预防疫苗gardasil和cervarix的问世，宫颈癌成为第一个可预防的肿瘤，目前接种hpv疫苗的人群在不断增加，由此，hpv疫苗接种效果的检测问题也随之产生。目前，用于抗体检测的elisa或者竞争性放射免疫分析法存在周期长、技术要求高等特点，难以满足对大批量疫苗接种人群的接种效果的检测，因此目前急需研发出一种能够批量测定hpv疫苗接种效果的方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种hpv抗体快速检测试纸条，其通过对全血中hpv抗体的定性测定，能够快速有效的检测疫苗是否接种成功，便于批量测定hpv疫苗的接种效果，提高了hpv疫苗接种效果的检测效率。

本发明的第二个目的是提供一种hpv抗体快速检测试纸条的制备方法，具有制备简单、便于批量生产的特点。

本发明的第三个目的是提供一种hpv抗体快速检测试纸条的使用方法，其操作方便，适合医院、疾控、基层、卫生单位检测及家庭自用，适合推广。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种hpv抗体快速检测试纸条，包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和手柄，所述样品垫的表面附着有柠檬酸-柠檬酸钠，所述结合垫上设置有抗人igg抗体-纳米金颗粒，所述分析膜上设置有检测带和质控带，所述检测带的主要成分为hpvl1，所述质控带的主要成分为与抗人igg抗体结合的二抗。

通过采用上述技术方案，本申请在使用时，样品滴定在样品垫上，利用试纸条的免疫层析，再结合以抗人igg抗体-纳米金颗粒和hpvl1作为双抗原，能够快速有效的检测疫苗是否接种成功，相对于elisa或者竞争性放射免疫分析法对hpv抗体的含量测定，本申请技术要求低且便于批量测定hpv疫苗的接种效果，从而有效提高了hpv疫苗接种效果的检测效率。

其原理具体为：倘若样品中含有hpv抗体，该hpv抗体先在结合垫上被抗人igg抗体-纳米金颗粒中的抗人igg抗体捕获结合，形成hpv抗体-抗人igg抗体-纳米金颗粒，随后样品继续在分析膜上扩散，检测带上的hpvl1能与hpv抗体结合，进而hpvl1对hpv抗体-抗人igg抗体-纳米金颗粒加以捕获并固定，形成hpvl1-hpv抗体-抗人igg抗体-纳米金颗粒，由此检测带因纳米金颗粒的存在而显色，表示hpv疫苗接种成功。反之，若未显色则说明hpv疫苗接种失败。

与此同时，样品继续在分析膜上扩散，质控带上的二抗能与抗人igg抗体结合，进而二抗对多余的抗人igg抗体-纳米金颗粒加以捕获并固定，形成二抗-抗人igg抗体-纳米金颗粒，由此质控带因纳米金颗粒的存在而显色，表示试纸条有效。

待样品层析结束后，多余的样品和抗人igg抗体-纳米金颗粒被吸水垫吸收，能够保证检测过程的整洁，手柄的设置便于人们的握持，以此操作人员的操作更为便捷。

另外，hpv抗体的检测通常是对全血的测定，本申请在样品垫吸附的上柠檬酸-柠檬酸钠能够为全血维持一个较为稳定的缓冲环境，减少全血的凝集，与此同时，还能改善分析膜的分子结构，加快抗体抗原在分析膜中的扩散速率，以此便于提高试纸条对hpv疫苗接种效果的测定速率。

进一步地，所述试纸条还包括底板，所述样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫沿层析方向依次固定于底板的一侧面上，所述手柄的一端与所述底板相连。

通过采用上述技术方案，底板的设置有助于为样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫提供良好的支撑作用，增加试纸条的结构强度，使得样品能够匀速的进行层析，保证试纸条的检测效率。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种hpv抗体快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

①、胶液的配制

将羧甲基纤维素钠和蒸馏水按1：99的重量比混合均匀，得到胶液；

②、柠檬酸-柠檬酸钠膏体的配制

将柠檬酸、柠檬酸钠和蒸馏水按2：8：90的重量比混合均匀，得到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

③、样品垫的浸润干燥处理

将样品垫浸入步骤②制得的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，润湿后取出沥干柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

④、试纸条的粘接成型

取出底板，在底板的一侧面涂覆上步骤①制得的胶液，先将分析膜铺设于底板的中部，再依次将结合垫铺设于分析膜在远离手柄的一端、将吸水垫铺设于分析膜在靠近手柄的一端、将经浸润干燥后的样品垫铺设于结合垫远离分析膜的一端，晾干蒸馏水后根据试纸卡的规格切割成一定的长度和宽度，即得所述的试纸条。

通过采用上述技术方案，本申请使用羧甲基纤维素钠作为粘结剂，通过胶粘和晾干蒸馏水的方式使得样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫稳定的固定于底板上，以此相对于热熔压制的方式能够较好的保证试纸条中如抗人igg抗体、二抗等组分的活性，实现试纸条的定性测定。

进一步地，所述样品垫的制备方法包括以下步骤：

a、将硝酸纤维素、高分子吸水树脂分别使用乙醇溶解，对应的形成nc胶液和树脂胶液；

b、用pvc片作为基层，采用静电纺丝法自下而上依次对树脂胶液和nc胶液进行纺丝，乙醇挥发完全后得到“nc膜-吸水层-基层”结构的样品垫。

通过采用上述技术方案，基层为nc膜和吸水层提供良好的支撑作用，使得样品垫具有一定的结构强度，其中nc膜和吸水层采用静电纺丝的方式制备而成，以此使得nc膜和吸收层具有较大的孔隙率，便于样品能够在样品垫中的扩散，加快试纸条的检测效率。

进一步地，所述结合垫的制备方法包括以下步骤：

c、将胶体金溶液的ph调节至6.0-6.4后与抗人igg抗体合并反应15-20min，随后加入bsa终止合并，依次经混匀、静置及离心，得到抗人igg抗体-纳米金颗粒；

d、将硝酸纤维素颗粒使用乙醇溶解，采用静电纺丝法制成片材，乙醇充分挥发后将步骤a中获得的抗人igg抗体-纳米金颗粒经分散稀释后涂覆在片材上，干燥后得到结合垫。

通过采用上述技术方案，胶体金溶液中的纳米金颗粒先与抗人igg抗体结合，bsa为牛血清白蛋白，其作为终止剂终止纳米金颗粒和抗人igg抗体的结合，以此能够快速有效的获得抗人igg抗体-纳米金颗粒，反应条件温和，保证了各组分的生物活性。硝酸纤维素采用静电纺丝方式制成的片材，其高孔隙率的特点有助于吸附较多的抗人igg抗体-纳米金颗粒，使得试纸条的结果显示较明显，便于操作者的观察。

进一步地，所述分析膜的制备方法为：将硝酸纤维素颗粒使用乙醇溶解，采用静电纺丝法制成片材，乙醇充分挥发后将hpvl1蛋白液和二抗间隔涂覆在片材上，经包被处理后进行干燥，分别在分析膜上对应形成检测带和质控带。

通过采用上述技术方案，分析膜由硝酸纤维素静电纺丝制成，能够为样品和抗人igg抗体-纳米金颗粒在分析膜中快速扩散，从而方便样品中的hpv抗体与hpvl1的快速有效结合以及抗人igg抗体与二抗的快速有效结合，加快了试纸条的检测效率。

进一步地，所述吸水垫的制备方法为：将高分子吸水树脂颗粒使用乙醇溶解，采用静电纺丝法制成片材，乙醇充分挥发后即得吸水垫。

通过采用上述技术方案，高分子吸水树脂具有良好的吸水性，其通过静电纺丝的方法制成相应的吸水垫，其高孔隙率能够锁定较多的样品，从而减少样品发生渗漏的可能性，以此保证检测的整洁性。

为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种hpv抗体快速检测试纸条的使用方法，包括以下步骤：

一、采集全血，将全血放置于待测容器中；

二、将试纸条设有样品垫的一端浸没于全血中，静置10±2min，至全血向上吸附至吸水垫；

三、观察试纸条在分析膜处的显示结果；

结果判读：两条红色杠表示hpv疫苗接种成功，仅在检测带上显示红色表示试纸无效，仅在质控带上显示红色表示hpv疫苗接种失败。

通过采用上述技术方案，本申请的试纸条在使用时，直接用全血加以测定，减少了对全血的处理步骤，但依旧能够准确检出全血中hpv抗体的有无，从而获知hpv疫苗接种的效果，具有步骤简单、操作方便的特点，适合医院、疾控、基层、卫生单位检测及家庭自用，适合推广。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本申请将免疫层析和双抗原结合至试纸条上用于hpv抗体的定性测定，能够快速有效的检测疫苗是否接种成功，具有技术要求低、便于批量测定、检测效率高的特点；

2、本申请中的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫均采用静电纺丝的方式制备相应的片材，便于样品的快速扩散以及有效的特异性结合，使得试纸条具有较高的检测效率；

3、本申请的试纸条在使用时直接使用全血作为样品，减少了对全血的处理步骤，但依旧能够准确检出全血中hpv抗体的有无，具有步骤简单、操作方便的特点，适合医院、疾控、基层、卫生单位检测及家庭自用，适合推广。

附图说明

图1为hpv抗体快速检测试纸条的结构示意图。

图中，1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、分析膜；5、吸水垫；6、手柄；7、检测带；8、质控带。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

一、原料准备

(一)硝酸纤维素：购自上海麦克林生化科技有限公司，货号为m840602。

(二)高分子吸水树脂(sap)：购自任丘惠香化工有限公司，货号为1131。

(三)pvc片：由pvc颗粒经挤出机压制而成，其厚度为1mm±0.2mm。

(四)抗人igg抗体：购自广州欧边生物制品的羊抗人igg抗体。

(五)胶体金溶液：购自北京德科岛金科技有限公司，货号为dk-au。

(六)hpvl1及其抗体：

利用基因克隆技术分别构建hpv16l1全基因及hpv18l1全基因于表达载体中，并利用大肠杆菌进行表达。

1、hpvl1蛋白液

1.1、扩增引物

根据hpv16l1基因参考序列(geneid:1489082)及hpv18l1基因参考序列(geneid:1489090)，设计hpvl1基因特异引物，用pcr方法扩增hpv16l1及hpv18l1基因(含限制内切酶识别位点)：

hpv16l1正向引物-sphi：5’-catgcatgccaggtgacttttatttacatc-3’

hpv16l1反向引物-saci：5’-cgagctccagcttacgttttttgcgttt-3’

hpv18l1正向引物-sphi：5’-catgcatgcgctttgtggcggcctagt-3’

hpv18l1反向引物-saci：5’-cgagctcctttctggcacgtacacgc-3’

1.2、模板和扩增

以提取的人宫颈癌细胞株hela(取自中国典型培养物保藏中心)细胞总dna为模板，使用上述特异引物进行hpv16l1及hpv18l1基因扩增。

pcr扩增体系为：10×taqbuffer5μl，taq酶0.25μl，dntpmixture4μl，dna模板2.5ng，正向引物(25μm)1μl，反向引物(25μm)1μl，灭菌蒸馏水补至50μl。

反应条件为：95℃30s，57℃30s，72℃100s，循环30次；72℃10min，循环1次。

pcr扩增产物约为1500bp，与ncbi数据库hpv16l1基因、hpv18l1基因大小一致。

1.3、重组质粒构建

将pcr扩增基因以及pqe80l质粒(上海北诺生物)分别进行sphi以及saci双酶切，酶切条件如下：pcr扩增产物300ng或pqe80l质粒100ng，10×kbuffer5μl，sphi2μl，saci2μl，灭菌蒸馏水补至50μl，于37℃反应8小时。

将酶切产物回收后进行连接，连接体系和条件为：10×ligasebuffer1μl，t4dnaligase0.5μl(350u/μl)，酶切扩增产物7.5μl，酶切pqe80l质粒1μl，于16℃反应8小时。其中，重组质粒大小为6.2kb。

1.4、hpvl1蛋白表达和分离纯化

1.4.1、将重组质粒在原核表达系统bl21中表达

将重组质粒转化大肠杆菌菌株bl21(上海北诺生物)，转化过程为：于离心管中将连接产物与50μlbl21感受态菌株混合后，冰上放置30min，42℃水浴热激45s后迅速放置于冰上，2min后向离心管中加入700μl不含抗生素(氨苄青霉素)的无菌lb培养基，混匀后37℃培养60min，5000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的lb培养基上，筛选阳性克隆，鉴定。

将转化成功的大肠杆菌菌株bl21在lb液体培养基中，于37℃培养至od600＝0.6～0.8，加入终浓度为1mm的iptg进行诱导表达8h。

1.4.2、用亲和层析纯化hpv16l1蛋白、hpv18l1蛋白

将诱导表达hpv16l1或hpv18l1的bl21菌体经超声波裂解以及离心。将上清液上镍柱(qiagenni-ntaspinkit)，经试剂盒中的漂洗液漂洗后，用洗脱液洗脱，收集表达蛋白，经sds-page分析确定纯化蛋白的大小，最终以大肠杆菌表达系统表达以及亲和层析纯化技术分别获取得到带有his标签的重组hpv16l1蛋白及重组hpv18l1蛋白，约为50kd，与ncbi数据库蛋白信息相符。

2、hpvl1抗体

2.1、hpvl1抗体的制备

将浓度为1mg/ml的重组hpv16l1蛋白及重组hpv18l1蛋白分别与弗氏免疫佐剂按照体积比1:1混合并免疫balb/c小鼠，每只小鼠免疫的重组hpv16l1蛋白或重组hpv18l1蛋白量为100μg，在初次免疫后的第14及28天以同样的计量加强免疫两次，在初次免疫后的第35天采集小鼠血清，利用proteing亲和纯化制备hpv16l1及hpv18l1蛋白的多克隆抗体。

亲和纯化过程为：将血清用结合缓冲液(20mm磷酸纳，ph7.0)上柱于proteing柱(invitrogenproteing)中，结合缓冲液漂洗后，用洗脱液(100mm甘氨酸，ph2.7)洗脱，洗脱液立即用中和缓冲液(1mtris-hcl，ph9.0)将收集到的多克隆抗体(hpv16l1或hpv18l1多克隆抗体)中和至中性。

2.2、hpvl1抗体的滴度检测

2.2.1先用重组hpv16l1蛋白及重组hpv18l1蛋白分别以1μg的量包被酶联免疫96孔板，包被板在4℃孵育过夜；

2.2.2用含0.05％的tween-20的pbst洗涤缓冲液(pbs中添加tween20)洗涤各孔6次，每孔加入封闭液(含5％脱脂奶粉的pbst溶液)100μl封闭2小时；

2.2.3每孔加入100μl用pbst溶液稀释200倍的多克隆抗体样品，于37℃反应1小时，然后用pbst溶液洗涤各孔4次，每次5分钟；

2.2.4每孔加入100μl辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠igg抗体，37℃反应1小时，然后用pbst溶液洗涤各孔6次，以除去未结合的酶标抗体；

2.2.5每孔加入100μltmb显色液，室温进行显色反应半小时；

2.2.6每孔加入50μl的反应终止液(2m硫酸溶液)终止显色反应，5分钟后用酶标仪测定450nm波长处的吸收值，并记录结果。

共测定了6只经过免疫的小鼠和一只未经免疫的阴性对照小鼠的血清抗体，其中3只被重组hpv16l1蛋白免疫小鼠的血清抗体在450nm波长处的吸收值分别为0.753、1.265及0.921，3只被重组hpv18l1蛋白免疫小鼠的血清抗体在450nm波长处的吸收值分别为0.620、0.843及0.802，而阴性对照小鼠血清抗体在450nm波长处的吸收值为0.045。由此判断，由重组hpvl1蛋白免疫小鼠能激活小鼠的免疫系统，并产生相应的hpv16l1及hpv18l1蛋白的特异性抗体，具有较高的免疫原性和结合特异性。

(七)二抗：与抗人igg抗体结合的抗体，即为hpvl1抗体。

二、实施例

一种hpv抗体快速检测试纸条，参见图1，包括底板1以及沿层析方向依次设置的样品垫2、结合垫3、分析膜4、吸水垫5和手柄6。其中，样品垫2、结合垫3、分析膜4和吸水垫5沿层析方向依次固定于底板1的一侧面上，手柄6的一端与所述底板1一体相连。样品垫2的表面附着有柠檬酸-柠檬酸钠，结合垫3上设置有抗人igg抗体-纳米金颗粒，分析膜4上间隔设置有一个检测带7和一个质控带8，检测带7的主要成分为hpvl1，所述质控带8的主要成分为与抗人igg抗体结合的二抗。

上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1、样品垫2的制备

a、将硝酸纤维素、高分子吸水树脂分别使用体积分数为95％的乙醇溶解，对应的形成固含量均为60％的nc胶液和树脂胶液；

b、用pvc片作为基层，采用静电纺丝法自下而上依次对树脂胶液和nc胶液进行纺丝，30％的湿度以下，在30℃的温度下待乙醇挥发完全，得到“nc膜-吸水层-基层”结构的样品垫2。

2、结合垫3的制备

c、取10ml胶体金溶液，用0.1m的碳酸钾溶液将ph调节至6.2，加入抗人igg抗体100μl，室温反应20min，随后加入bsa至终浓度(质量分数)为0.5％终止合并，混匀、静置10min，4℃、2000rpm离心20min，弃去沉淀，上清液于4℃、12000rpm离心60分钟，弃去上清，沉淀溶于1ml的pbs(内含质量分数0.2％bsa)中，得到抗人igg抗体-纳米金颗粒；

d、将硝酸纤维素颗粒使用体积分数为95％的乙醇溶解，采用静电纺丝法制成片材，30％的湿度以下，在30℃的温度下待乙醇挥发完全，将步骤a中获得的抗人igg抗体-纳米金颗粒用pbs(内含质量分数0.2％的bsa)100μg分散稀释1倍后，利用喷涂仪均匀的涂覆在片材上，涂覆量为1ml/cm2，30％的湿度以下，36℃干燥20h，得到结合垫3。

3、分析膜4的制备

e、将硝酸纤维素颗粒使用体积分数为95％的乙醇溶解，采用静电纺丝法制成片材，30％的湿度以下，在30℃的温度下待乙醇挥发完全；

f、将hpvl1蛋白液和二抗分别用pbs稀释至浓度为2mg/ml，在步骤e制得的片材上分别划线，hpvl1蛋白液作为检测带7，二抗作为质控带8，且两者间距6mm，以此使得检测带7和质控带8固化在片材上，即得分析膜4。

4、吸收垫的制备

将高分子吸水树脂颗粒使用体积分数为95％乙醇溶解，采用静电纺丝法制成片材，30％的湿度以下，在30℃的温度下待乙醇挥发完全，即得吸水垫5。

5、试纸条的组装

①、胶液的配制

将羧甲基纤维素钠和蒸馏水按1：99的重量比混合均匀，得到胶液；

②、柠檬酸-柠檬酸钠膏体的配制

将柠檬酸、柠檬酸钠和蒸馏水按2：8：90的重量比混合均匀，得到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；③、样品垫2的浸润干燥处理

将样品垫2浸入步骤②制得的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，润湿后取出，30％的湿度以下，在30℃的温度下沥干柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

④、试纸条的粘接成型

取出底板1，在底板1的一侧面涂覆上步骤①制得的胶液，先将分析膜4铺设于底板1的中部，再依次将结合垫3铺设于分析膜4在远离手柄6的一端、将吸水垫5铺设于分析膜4在靠近手柄6的一端、将经浸润干燥后的样品垫2铺设于结合垫3远离分析膜4的一端，晾干蒸馏水后根据试纸卡的规格切割成10cm×1.2cm的尺寸，即得所述的试纸条。其中，结合垫3和吸收垫分别与分析膜4的两端部分重叠，且分析膜4位于结合垫3和吸收垫的下侧；样品垫2的一端与结合垫3在远离分析膜4的一端部分重叠，且结合垫3位于样品垫2下方。

三、hpv抗体的检测

一种hpv抗体快速检测试纸条的使用方法，包括以下步骤：

(一)、采集全血，直接取2ml全血放置于检测试管中；

(二)、将试纸条设有样品垫2的一端浸没于全血中，静置10±2min，至全血向上吸附至吸水垫5；

(三)、观察试纸条在分析膜4处的显示结果；

结果判读：两条红色杠表示hpv疫苗接种成功，仅在检测带7上显示红色表示试纸无效，仅在质控带8上显示红色表示hpv疫苗接种失败。

样本采集举例

本申请邀请100名接种有hpv疫苗的健康女性作为志愿者。其中，30名接种二价疫苗，年龄分布在25-40岁；50名接种四价疫苗，年龄分布在25-40岁；20名接种九价疫苗，年龄分布在16-25岁。

采集志愿者的全血，每个志愿者的全血作两组平行，分布使用本申请的试纸条和现有技术的elisa对志愿者的接种效果加以测定，其测定结果参见下表一。

表一100名志愿者的接种效果测定结果

由表一可得，本申请试纸条的检测结果与采用elisa法测定的检测结果一致，因此本申请试纸条具有良好的检测准确性，能够快速有效的检测疫苗是否接种成功，便于批量测定hpv疫苗的接种效果，提高了hpv疫苗接种效果的检测效率。

四、对比例

与实施例的区别之处在于，本对比例中样品垫、结合垫和吸水垫直接由市面上购得的高分子吸水树脂挤出压片制得，分析膜购自上海臣莲生物科技。使用对比例制得的试纸条对上述志愿者的hpv疫苗接种效果加以测定，其检测结果参见下表二。

表二100名志愿者的接种效果测定结果

由表二可得，本申请的试纸条能够快速有效的对hpv疫苗接种效果加以定性测定，与此同时，还能有效缩短其检测时长，从而提高了hpv疫苗接种效果的检测效率，能够适合医院、疾控、基层、卫生单位检测及家庭自用，可以被大量推广使用。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。