一种抗原高压蒸热修复装置和修复方法与流程

本发明涉及组织抗原修复技术领域，尤其涉及一种抗原高压蒸热修复装置和修复方法。

背景技术：

免疫组化染色过程中，为了充分暴露抗原，增加组织通透性，促进抗原抗体结合，使抗原充分显色，需要对抗原进行修复，本发明涉及一种防止组织脱片的抗原高压蒸热修复装置和方法。目前通用的方法是将携带组织的切片浸入到修复液中，而这种方法极其容易导致组织脱片，从而无法继续免疫组化染色。

技术实现要素：

有必要提出一种抗原高压蒸热修复装置。

还有必要提出一种抗原高压蒸热修复方法。

一种抗原高压蒸热修复装置，包括下支撑机构、隔离机构、承载机构、载片机构、定位机构，所述下支撑机构的下端放置于外部加热高压装置内部，上端放置所述承载机构，所述承载机构包括至少一个载片盘，隔离机构包括至少一个立柱，所述载片盘从下向上依次设置，立柱设置于相邻的两个载片盘之间，载片机构包括至少一个切片固定盒及设置于切片固定盒内载玻片、盖玻片，盖玻片放置于载玻片上表面上，载玻片、盖玻片之间用于放置待修复组织及修复液，另外在载片盘的中间位置开设限位孔，定位机构的下端贯穿插入至每个载片盘的限位孔内，上端位于最上层的载片盘的上方，所述载片盘上开设若干气孔。

优选的，还在载片盘的上表面和下表面上靠近边缘处设置向内凹陷的定位沉槽，所述立柱的端部卡合在所述定位沉槽内。

优选的，所述切片固定盒包括相对设置的左半体和右半体，左半体和右半体均具有一个台阶槽，以供载玻片的端部放置，所述台阶槽的下表面放置在载片盘上，台阶槽的高度为至少1mm，以使左半体和右半体之间的载玻片与载片盘的表面不接触，进而不会封堵载片盘的气孔。

优选的，所述载玻片的上表面和盖玻片的下表面相对设置，载玻片的上表面为光滑平面，盖玻片的下表面为光滑平面。

优选的，定位机构包括细长条状体，所述细长条状体的长度可调节。

优选的，所述抗原高压蒸热修复装置还包括积液盘，积液盘为顶部开口的盘体，在盘体内部盛放提供蒸汽的修复液，所述载玻片和盖玻片之间浸没组织的修复液与积液盘内的修复液一致。

优选的，所述载玻片和盖玻片之间浸没组织的修复液与积液盘内的修复液均为柠檬酸钠修复液。

一种抗原高压蒸热修复方法，包括以下步骤：

滴加1ml修复液至携带组织的载玻片上，盖上盖玻片；并将其两端放置在切片固定盒的左半体和右半体上；

将最下层的载片盘放置在外部加热高压装置内部，在外部加热高压装置内部注入修复液，再将若干上述切片固定盒放置载片盘上；

依次放置上一层的载片盘和切片固定盒；

开启外部加热高压装置为组织提供高压、高温的热蒸汽，对组织进行修复。

优选的，外部加热高压装置内部注入的修复液与载玻片和盖玻片之间浸没组织的修复液一致。

本发明中，通过充分高压蒸热修复抗原，提高组织通透性，有效提高免疫组化成功率；通过分层放置在多个载片盘，可同时热修复多张切片，提高单次修复的样本量；组织切片水平放置，载玻片和盖玻片位置均被切片固定盒固定，有效防止沸腾修复液剧烈冲击组织。

附图说明

图1为抗原高压蒸热修复装置的结构示意图。

图2、3为载片盘的结构示意图。

图4、5为载片机构的俯视图、主视图。

图6为左半体的右视图。

图7为放置了组织和修复液的示意图。

图8为下支撑机构的结构示意图。

图中：下支撑机构10、立柱20、载片盘30、气孔31、定位沉槽32、载片盘抓手33、限位孔34、载片机构40、切片固定盒41、左半体411、右半体412、台阶槽413、载玻片42、盖玻片43、细长条状体50、圆盘座51、积液盘60、修复液70、高压锅100、组织200。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

参见图1，本发明实施例提供了一种抗原高压蒸热修复装置，包括下支撑机构10、隔离机构、承载机构、载片机构40、定位机构，所述下支撑机构10的下端用于放置于外部加热高压装置内部，可以为高压锅100，上端放置所述承载机构，所述承载机构包括至少一个载片盘30，隔离机构包括至少一个立柱20，所述载片盘30从下向上依次设置，立柱20设置于相邻的两个载片盘30之间，以将相邻两个载片盘30分割开来，载片机构40包括至少一个切片固定盒41及设置于切片固定盒41内载玻片42、盖玻片43，盖玻片43放置于载玻片42上表面上，载玻片42、盖玻片43之间用于放置待修复组织200，还在载片盘30的中间位置开设限位孔34，定位机构的下端贯穿插入至每个载片盘30的限位孔34内，上端位于最上层的载片盘30的上方，所述载片盘30上开设若干气孔31。其中，下支撑机构10为较长圆柱体。

本装置中通过下支撑机构10将下层的载片盘30与底部隔离，避免修复液70与载片盘30接触，进而实现通过蒸汽对组织200的热修复，本装置的载片盘30设置多个，相互之间采用立柱20隔离开来，每一层都可以放置至少6-12个载片机构40，不仅增大单次热修复组织200的样本数量，而且相邻的载片盘30之间的立柱20是可以活动放置和拆卸的，这与整体的多层结构是不一样的，此种设计中，活动放置的每一层载片盘30可以单独拿下来、放进去，由于放置切片固定盒41时，在载玻片42和盖玻片43之间已经放置了组织200和修复液70，组织200已经浸入在修复液70中，所以，将该切片固定盒41放置在载片盘30上时，需要水平放置，先放置最下层载片盘30，再将6-12个切片固定盒41从该载片盘30的上方放置在载片盘30上，放置过程中保持水平，然后再放第二层载片盘30，再从上方将若干切片固定盒41从该第二层载片盘30的上方放置在在载片盘30上。而对于整体多层结构而言，放置切片固定盒41时，需要从侧方将其插入载片盘30的上方，这就不好把握其水平性，容易倾斜，使得载玻片42和盖玻片43之间的修复液70流出。

其中，所述若干气孔31包括若干大孔和若干小孔。

进一步，还在载片盘30的上表面和下表面上靠近边缘处设置向内凹陷的定位沉槽32，所述立柱20的端部卡合在所述定位沉槽32内。

虽然立柱20的设置是为了实现相邻的载片盘30之间的可拆卸装配，但是在高压高温状态下，且修复液70是沸腾状态，修复液70蒸汽对载片盘30会造成一定的冲击力，如果立柱20与载片盘30表面之间采用平面接触，使得载片盘30与立柱20之间相互错位或滑动，容易滑脱，所以通过定位沉槽32将立柱20和载片盘30相对限位，避免受蒸汽冲击而滑脱。

进一步，所述切片固定盒41包括相对设置的左半体411和右半体412，左半体411和右半体412均具有一个台阶槽413，以供载玻片42的端部放置，所述台阶槽413的下表面放置在载片盘30上，台阶槽413的高度为至少1mm，以使左半体411和右半体412之间的载玻片42与载片盘30的表面不接触，进而不会封堵载片盘30的气孔31。

切片固定盒41的设置，可以先将载玻片42、组织200、盖玻片43放置在切片固定盒41内，然后再将切片固定盒41放置在载片盘30上，这样，使得载玻片42、盖玻片43和组织200的放置工作在外部单独提前操作，而且左半体411和右半体412的台阶槽413限制了载玻片42和盖玻片43的相对位移，避免二者相对滑动和错位，然后将切片固定盒41放置在载片盘30上，这与不设置切片固定盒41的操作是完全不同的，如不设置切片固定盒41，人员只能先将载玻片42放置在载片盘30上，再放组织200，再滴修复液70，最后再盖上盖玻片43，这样操作，由于人员在外部，而载片盘30在高压锅100内部，不能近距离观察和操作，误差较大，或者人员在外部将这三者放置好之后，再手握载玻片42的边缘，移放在载片盘30上，这样，因为没有切片固定盒41的限制作用，移动时，载玻片42和盖玻片43很容易错位滑动。

切片固定盒41的设置，左半体411和右半体412具有一定的厚度，且左半体411和右半体412的底面积也很小，使得放置载玻片42之后，载玻片42不与载片盘30直接接触，不会封堵气孔31，使得蒸汽上下流通通畅，而且与现有技术相比，如果将载玻片42直接与载片盘30平面接触，蒸汽的气流会将载玻片42冲击至移位，所以，左半体411和右半体412的设置具有显著的效果。

现有技术中只是采用的单层的载片盘30来操作，样本量较小。且载玻片42是直接放置在载片盘30上的。

进一步，所述载玻片42的上表面和盖玻片43的下表面相对设置，载玻片42的上表面为光滑平面，盖玻片43的下表面光滑平面。其中，优选的为载玻片42的上表面和盖玻片43的下表面相对紧贴。

待修复的组织200放置在载玻片42和盖玻片43之间，且被修复液70浸没，修复液70是液体状态，在浸没组织200之后，载玻片42和盖玻片43之间的液体由于液体表面分子间的相互吸引力，不易向外扩散，从而保证载玻片42和盖玻片43之间不会错位滑动，并且组织200也不易暴露在修复液70外部。而对于盖玻片43下表面是毛面的方案中，修复液70与毛面之间参与很多的气泡，气泡在受到高温蒸汽的作用下，活跃性很大，容易进入到修复液70内部，进而与组织200接触，使得组织200表面受热不均匀。

进一步，定位机构包括细长条状体50，所述细长条状体50的长度可调节。例如细长条状体50由上半截和下半截组成，二者之间采用螺纹连接。还在细长条状体50的下端端部设置圆盘座51。以使定位机构稳定支撑放置。

进一步，所述抗原高压蒸热修复装置还包括积液盘60，积液盘60为顶部开口的盘体，在盘体内部盛放提供蒸汽的修复液70，所述载玻片42和盖玻片43之间浸没组织200的修复液70与积液盘60内的修复液70一致。

当提供蒸汽的修复液70与浸没组织200的修复液70不一致时，例如，提供蒸汽的修复液70为水或其他液体，形成蒸汽后密布于载玻片42和盖玻片43周围，包括二者之间，则这些蒸汽就会对浸没组织200的修复液70形成稀释，导致修复液70的浓度不能达到要求，修复效果也不能达到设定的要求。所以，本方案中，二者采用一致的修复液70，即使蒸汽密布于组织200的修复液70周围，由于二者的物质是一样的，也不存在稀释的作用。

待修复组织多种多样，对于面积较大的组织而言，放置在载玻片上后面积较大，修复液将该组织全部浸没后，但是由于该组织面积较大，其边缘靠近载玻片的边缘，此处的修复液量较少，例如图7中的201位置点，其周围的修复液量很少，容易被高温蒸发，也很容易被稀释，所以设置该方案，避免稀释对此处组织的影响。高压锅内的温度。

进一步，所述载玻片42和盖玻片43之间浸没组织200的修复液70与积液盘60内的修复液70均为柠檬酸钠修复液70。

一种抗原高压蒸热修复方法，包括以下步骤：

放置载玻片42，再将待修复的组织200放置在载玻片42上，在组织200上滴修复液70，至修复液70将组织200浸没，盖上盖玻片43；

将放置了组织200和盖玻片43的载玻片42的两端放置在切片固定盒41的左半体411和右半体412上；

将最下层的载片盘30穿过50细长条状体放置在外部加热高压装置内部，在外部加热高压装置内部注入修复液70，再将若干上述切片固定盒41放置载片盘30上；

依次放置上一层的载片盘30和切片固定盒41；

开启外部加热高压装置为组织200提供高压、高温的热蒸汽，对组织200进行修复。

进一步，外部加热高压装置内部注入的修复液70与载玻片42和盖玻片43之间浸没组织200的修复液70一致。

对组织200进行热修复之前还可以包括组织200切片和脱蜡及水化的步骤，对组织200进行热修复之后还可以包括抗原抗体结合、复染、脱水、透明及封片、拍照、保存步骤。

以下说明一种较佳的实施例，该实施例采用的修复装置为上述抗原高压蒸热修复装置，采用的热修复方法为上述的抗原高压蒸热修复方法，具体实施步骤为：

（一）、组织200切片：降温，标记，切片，展片，捞片，烤片。

1.降温

放置蜡块于4度冰箱保存，过夜。切片前，将蜡块埋在碎冰中，边切边拿，发现切出的组织200断裂时，必须将蜡块再次放入碎冰中降温3分钟后，再继续切片。

2.标记

切片前，在载玻片42上标记好蜡块编码及样本信息，捞片时，一一对应。

3.切片

切片时，刀片从左到右分成abc三段，首次修理蜡块可用a段，修切平整后可用b、c段切取需要的组织200；组织200切片厚度根据组织200属性切成3或5μm。

4.展片

水槽水温调制40ºc，切片浮在水面至完全展开，无皱褶时，方可捞起。

5.捞片

用镊子离断连接的多个组织200样本，载玻片42正面与水面成45º角，深入到组织200下方后，定位确保组织200在载玻片42合适范围内，方可捞起。

6.烤片

将附着组织200的载玻片42平行放置在烤片机上，烘烤3分钟，待载玻片42上无残留水滴时，将其插入载片架，放置在60ºc烘箱过夜。

（二）、脱蜡及水化

1．将附着组织200的载玻片42浸泡在第一个二甲苯溶液中6分钟后取出；

2．浸泡在第二个二甲苯溶液中6分钟后取出；

3．浸泡在第三个二甲苯溶液中6分钟后取出；

4.浸泡在第一个100%乙醇中5分钟后取出；

5.浸泡在第二个100%乙醇中5分钟后取出；

6.浸泡在第一个95%乙醇中3分钟后取出；

7.浸泡在第二个95%乙醇中3分钟后取出；

8.浸泡在85%乙醇中2分钟后取出；

9．浸泡在75%乙醇中1分钟后取出；

10．流动自来水冲洗5分钟；

11.浸泡在蒸馏水中1分钟；

12.将附着组织200的载玻片42转移至柠檬酸钠修复液70中。

（三）、抗原蒸热修复：

1.在高压锅100(直径20cm，高度13cm；或者其他尺寸)中加入柠檬酸钠抗原修复液70300ml、ph6.0（柠檬酸钠抗原修复液70可以通过1袋柠檬酸钠+1000ml纯水调配形成）；

2.调整下支撑机构10高度,放入至修复液70中(下支撑结构10的上顶端高出修复液70面5cm。

3.将1个载片盘30穿入细长条状体50，放置在下支撑机构10上。若一个载片盘30不够放置所有组织200切片，则将第2个载片盘30穿入细长条状体50，卡在定位沉槽32中，立柱20支撑其平稳放置在第1个载片盘30上方。

4.打开电磁炉，功率调制300w，进行缓慢加热。

5.滴加1ml柠檬酸修复液70在载玻片42上，盖上盖玻片43，检查盖玻片43与载玻片42紧密贴合，排空气泡，轻轻将载玻片42插入至切片固定盒41里（标签端放置在载片盒高端），切片固定盒41平放在载片盘30上。挪到3

6.盖上锅盖，将功率调至2100w，待高压锅压力阀升起后将功率降至1800w，计时2分钟，修复液70蒸汽从高压锅100底部通过排气大孔和排气小孔31排出，关炉，室温冷却10分钟后，打开锅盖，继续冷却5分钟。

7.浇少量常温柠檬酸钠修复液70至载玻片42上，降温切片；通过载片盘抓手33提出载片盘30，取出切片，轻轻将盖玻片43取下，蒸馏水浸泡载玻片3分钟，3%h2o2浸泡10分钟，pbs浸泡6分钟，将载玻片转移置于湿盒中。

（四）、抗原抗体结合：快速甩动载玻片，将组织上液体甩离；用滤纸将载玻片42上组织200周围残留的液体吸干，切记滤纸不能触碰组织。室温下加5%bsa（40ul/条组织），放入湿盒中，20分钟后，加入第一抗体（40ul/条组织，提前在组织200周围用免疫组化笔画圈，以避免抗体移位），置于4℃冰箱过夜；pbs冲洗3遍，间隔3分钟，用滤纸将组织周围的液体吸干，加入反应增强剂（40ul/条组织）20分钟，pbs冲洗3遍，间隔4分钟，用滤纸将组织周围的液体吸干；加入二抗，放入37℃烘箱30分钟，pbs冲洗3遍，间隔3分钟，用滤纸将组织周围的液体吸干；加dab显色液（40ul），显微镜下观察，组织出现浅棕色，立即用蒸馏水冲洗直至dab完全冲离，收片，继续用自来水冲洗5分钟，dab废液回收。

（五）、复染：苏木素染液染色1分钟，自来水冲洗1分钟，0.6%盐酸酒精分化1秒，自来水冲洗1分钟返蓝。

（六）、脱水、透明及封片：75%乙醇1分钟、85%乙醇1分钟、95%乙醇1分钟、100%乙醇1分钟、100%乙醇1分钟、二甲苯2分钟、二甲苯2分钟、中性树胶封片，晾片。

（七）、拍照、保存

note:酒精及二甲苯根据已做片子数量（300张左右）及时更换。

本发明实施例装置中的模块或单元可以根据实际需要进行合并、划分和删减。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。