专利名称：一种用靶向探针技术检测高血脂血清的方法
该技术属分子生物学技术及其在临床检测中的应用现有技术经国际专利检索在现有用于胆固醇及高低密度脂蛋白测试法的研制技术中可归纳为两类一类是专利Jp 03304800以及专利CN 1048925A为代表的直接显示法，另一类是以专利Jp 63085357为代表的通过免疫学手段进行如夹心法、ELISA法它们是利用一种抗体或两种抗体进行检测的技术。上述两类方法虽已较广泛的应用于血糖尿糖及血液中氨基酸检测，无论是干法还是湿法都有一个成本昂贵，操作手段繁杂以及对反应物不受保护的局限性。
专利Jp 63085357该方法需四步完成，包括四部分内容1、血液中apolipoprotein(LDL)滴在检测试剂的干纸片上；2、采用表面活性剂Triton x-100溶出低密度脂蛋白(LDL)；3、通过免疫学测定方法检测血液中低密度脂蛋白；4、血液中低密度脂蛋白的测定方法是检测高胆固醇血症的诊断方法。
专利Jp 02163657该方法用于粪便潜血检测的装置，是在一个长方形的疏水片上，通过小孔检测粪便潜血的一个装置。
专利Jp 03004800该方法是用于定性的胆固醇单项检测纸，定性用或用水浸出液对纸片上颜色进行定量用。
专利CN 1048925A本方法是采用纯化学偶联的方法将下述三部连接成一个整体ABC，其中A为亲胆固醇的试剂如脂类、蛋白质B为胆固醇酶促产物的显色剂C为A、B的交联剂，C具有连接A和B的双功能化学试剂为弥补上述的不足本专利采用靶向探针的技术在比较短的时间内通过微量级检测达到定量与半定量的检测效果。无论是干法还是湿法在测试卡的制备上方法简便成本低廉，检测手段简易可行，使用效率高，可为常规比色法提高效率30倍，即每10-20分钟内可完成30人次检测。如每人次检测3个指标则90个测试数据的高效率为本方法检测血液中总胆固醇，高低密度脂蛋白的测试手段。
发明的目的在步入老龄化的人群中，与高脂血、高胆固醇相关的疾病如动脉粥样硬化、糖尿病、肾综合症等等，严重危害人们的健康，成为中老年人群中的常见病和多发病。在1994年美国医学学会杂志中文版第73卷第3期中指出“国家胆固醇教育规划关于成年人高胆固醇血症的检测评估和治疗的第二次专项调查报告”一文中指出；应继续把低密度脂蛋白视为降低胆固醇的主要目标。可见高胆固醇血症、低密度脂蛋白的升高是全球关注的中老年病的危险因素之一，波及面甚广。为方便中老年人掌握自己的健康，随时了解治疗效果解脱病人看病难、检测取血量大的困难与病人痛苦，减少病人交叉感染的机会，提高临床检测效率则是当前急待解决的问题。
为此，本发明所涉及的技术及内容具有先进性、新颖性，除了能满足上述要求外，更能为高脂血病人配合医务人员进行饮食治疗或药物治疗提供及时的证据。
发明的内容及方案靶向探针技术是指该技术能够靶向脂蛋白胆固醇酯探测胆固醇，以呈色反应显示血脂浓度的一种技术，该技术的实现与制备靶向探针的包被原料及其DRV特性悉悉相关。即当高脂血清与靶向探针相接触的瞬间，在高浓度胆酸盐和磷酸盐的介导下，所完成的脂蛋白胆固醇酯与靶向探针之间疏水基团相互作用过程，过程中脂蛋白胆固醇酯在系列酶的作用下完成并实现了酶促反应终产物与探针之间的显色反应。色度的深浅显示脂蛋白胆固醇含量的高低。
该靶向探针在指示血脂浓度时具有三个特异性结合过程1、血清中只有脂蛋白胆固醇酯能够与靶向探针快速结合；2、被结合的脂蛋白胆固醇酯能特异性的与系列酶发生酶促反应；3、酶促反应的终产物与其能呈选择结合的染料结合并呈现显色反应，避免了外界环境的干扰，见图1、图2。
优点及效果是将靶向探针的完整结构固相于纸片上成为干法的纸卡，以及固相于测定板上成为湿法的测定板为主要技术路线。是属领先技术，亦是填补空白技术。她区别于常量的比色法亦区别于微量的免疫技术测试卡以及用聚脂和聚胺浸沾的纸卡。
该技术的特点是将已制备好的能靶向脂蛋白胆固醇酯并能探测胆固醇的探针这样一个完整结构固相于国产定量滤纸片上或测试板上，靶向探针的制备过程不涉及到化学反应，而血清中脂蛋白胆固醇酯与靶向探针所呈现的颜色反应则纯属生物化学领域中分子之间的反应。她即能方便存放，又能达到保护检测试剂的良好效果。测试卡及测定板的特点及优点是1、体积小轻便，便于存放及携带；2、无试剂外溢，不污染环境；3、使用方便，简化操作手续，适于临床检测及家用测试；4、本方法(干、湿法)属微量测定，三个测试指标需6-50微升指血，检测时需血量少，减少病人痛苦及交叉感染的机会；5、测程短效果高，每人次需时10-20分钟(干法)单位时间内湿法比常规法提高约30倍的效率；6、该方法中干法可为医生提供保守治疗和药物治疗的证据，适于家用。
实施例实施例1湿法可用于定量的靶向探针测定板的制备方法1、靶向探针的制备方法1.1探针组成于每平方厘米测定板加入31μl-100μl，含有下述试剂成份的混合液磷酸盐 维持pH为7.7 0.04-0.09μmoL4氨基安替比林 0.07-0.20μmoL胆酸钠盐 0.42-0.93μmoL酚(重蒸的)0.49-1.09μmoL胆固醇脂肪酶 0.1160-0.2480I、U胆固醇氧化酶 0.0558-0.1240I、U过氧化物酶0.6975-1.5500I、U1.2、将1.1中所示探针内含物与麦醇溶蛋白以E1cm280nm·1％近似于0.7的浓度按(3-1)∶(0.01-3)的比例逐滴混合于4-8℃低温下，通过200γpm转速的20分钟搅拌，完成靶向探针的制备。控制乙醇浓度为10-40％。
1.3、取出上述靶向探针均匀的铺到测定板上冷冻干燥完成固相制备。
1.4、探针所用颜色除4氨基安替比林也可使用各种隐性颜料等如隐性孔雀缘，隐性结晶紫，荧光标记物，放射性标记物。
2、低密度脂蛋白沉淀片每平方厘米纸片上加入5μl-PVS(Polyvinylphyrolidonesolution)pH6-8，(PVP与磷酸缓冲液PBS的比为(5-10)∶100)混合沉淀剂冷冻干燥-10℃—-20℃。
3、高密度脂蛋白沉淀片每平方厘米纸片上加入10μl PTA(Phosphotungstie acid)和Mg与混合物，二者的比为9.7(m mol)∶0.4(mol)并冷冻干燥温度为-70℃—-20℃。
4、红血球过滤片采用国产微孔滤膜孔径0.3—0.80μ，将指血滴到此滤片上，红血球被隔到膜上，血清透过膜。
5、测试板的组装分二部分5.1、分别将低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的沉淀片上各盖一个0.3-0.80μ直径的微孔滤膜，做为得到除掉低高密度脂蛋白的及红血球的血清的装置。
5.2、定量量取实施例5.1装置所处理过的血清，温度37℃5分钟，于靶向探针测试板上。
5.3、处理过的血清样品通过420-500nm滤光片进行比色测定与标准样品进行比较确定血样中脂蛋白含量。
6、测试卡及测试板上选用血清量为2-10μl血清。
实施例2干法半定量靶向探针测定卡的制备方法1、靶向探针制备方法同实施例1中的1.1和1.2，只不过在1.3中将湿法的测定板改成1平方厘米的国产定量滤纸纸片做为固定靶向探针的支持物。
2、低密度脂蛋白沉淀片制备方法同实施例1中23、高密度脂蛋白沉淀片制备方法同实施例1中34、红血球过滤片制备方法同实施例1中45、测试卡的组装实施例3靶向探针与兔红细胞膜的亲和作用按实施例1中制备的靶向探针与兔红血球碎片于4℃温度下或室温下放置，可见到兔红血球碎片与靶向探针的亲和现象。
实施例4靶向探针的另一制备途径按实施例1中取麦醇溶蛋白与戊二醛与荧光抗体的比例为(0.5-2.5)∶(0.5-5.0)∶(0.1-1.5)的比例进行顺序逐滴混合后于室温下放置2-4小时，完成标记荧光抗体靶向相应抗原的探针。
图1靶向探针与血清脂蛋白胆固醇酯结合前照片(显微镜放大10×10)图2靶向探针与血清脂蛋白胆固醇酯结合后照片(显微镜放大10×10)
权利要求
1.一种用靶向探针技术检测高血脂血清的方法，其特征在于所述方法包括靶向探针的制备、低密度脂蛋白沉淀片、高密度脂蛋白沉淀片、红血球过滤片选择、测试板的组装等；1)在每平方厘米测定板加入31μl-100μl试剂，此试剂为下述成份的混合液，磷酸盐 维持pH为7.7 0.04-0.09μmoL4氨基安替比林0.07-0.20μmoL胆酸钠盐 0.42-0.93μmoL酚(重蒸的) 0.49-1.09μmoL胆固醇脂肪酶 0.1160-0.2480I、U胆固醇氧化酶 0.0558-0.1240I、U过氧化物酶 0.6975-1.5500I、U将上述探针内含物与麦醇溶蛋白以E1cm280nm·1％为近似于0.7的浓度按(3-1)∶(0.01-3)的比例在4-8℃温度下逐滴混合，然后在4-8℃温度下用200γpm转速搅拌20分钟，完成靶向探针的制备；取出上述靶向探针物质将其均匀的铺到测定板或纸片上冷冻干燥，完成固相制备；2)低密度脂蛋白沉淀片的制备在每平方厘米纸片上加入5μlPVS(PolyVinylphyrolidoneSolution)(PVP与磷酸盐缓冲液PBS混合沉淀剂)在-10℃—-20℃冷冻干燥；3)高密度脂蛋白沉淀片的制备在每平方厘米的纸片上加入10μlPTA(phosphotungstic acid)和Mg++混合物，在-10℃—-20℃下冷冻干燥；4)红血球过滤片的选择采用国产微孔滤膜孔径在0.30-0.80μ做为血清透过膜；5)测试板的组装分别将低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的沉淀纸片上各盖一个0.3-0.8μ直径的微孔滤膜，做为除掉低、高密度脂蛋白的及红血球的血清的装置；然后定量量取经上述装置处理过的血清放入在靶向探针测试板上温育37℃5分钟；将上述温育后的血清于420-500nm滤光片下进行比色测定，测定后与标准样品进行比较确定血样中脂蛋白胆固醇的含量。
2.根据权利要求1、1)中所述，其特征在于靶向探针内含物与麦醇溶蛋白混合时乙醇浓度控制在10-40％。
3.根据权利要求1、3)中所述，其特征在于PVP与PBS的比为(5-10)∶100，pH6-8。
4.根据权利要求1所述靶向探针技术，其特征是适用于制备多种测试卡及测定板，例如测定血糖，尿糖等。
5.根据权利要求1所述靶向探针技术，其特征是适用于制备各种外敷贴片制剂，例如硝酸甘油贴片。
6.根据权利要求1所述靶向探针技术，其特征是适用于制备口服缓释片剂及检测用的药物片剂。
全文摘要
一种用靶向探针技术检测高血脂血清的方法靶向探针是通过探针包被物与血清中脂蛋白胆固醇酯之间在高盐的介导实现的，疏水相互作用，探针与脂蛋白胆固醇酯的特异性结合完成的。之后在系列酶的作用下，酶促反应终产物的显色反应，呈色的深度显示血脂的含量。本检测分湿法及干法两种，干法为半定量法适于家用，亦可为临床治疗手段提供证据。湿法为微量定量法，适于临床化验用。
文档编号G01N33/49GK1114421SQ95104968
公开日1996年1月3日 申请日期1995年5月17日 优先权日1995年5月17日
发明者王素云 申请人:北京大学