检测生物样品中dna、rna和蛋白质的方法
【专利说明】检测生物样品中DNA、RNA和蛋白质的方法
[0001]背景
多种不同方法可用于生物学和医学中，以观察生物样品中的不同靶标。例如，组织切片和其它细胞制备物中的蛋白质分析可使用组织化学、免疫组织化学(IHC)、或免疫荧光的技术来进行。
[0002]重复分析单个样品的方法描述于美国专利号7，629，125和美国专利号7，741，046。具体地讲，美国专利号7，741，046提供了检测生物样品中的多个靶标的方法，其包括利用氧化以灭活信号发生器(例如，漂白荧光染料)。
[0003]蛋白质和DNA靶标的原位检测常规用作癌症控制的诊断工具。近年来已经开发了在相同组织切片中同时检查这些靶标的方法，以测定这些标记彼此的相关性以及这些标记与临床参数的相关性。另一重要的细胞靶标是RNA。已经鉴定了多种不同的RNA种类，除了作为蛋白质合成的模板外，它们中的许多例如miRNA还控制基因表达并因此控制细胞功能和/或疾病进程。RNA稳定性提出了独特的挑战性并且通常需要极其谨慎以防RNA酶污染。因此适当的是在过程早期进行RNA检测。然而，在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中进行RNA检测的现有方法通常是在广泛蛋白酶处理后进行，这与蛋白质靶标的下游检测不相容。
[0004]本文公开的是检测RNA种类的方法，无需蛋白酶处理并且在相同样品中同时检测3种靶标:蛋白质、DNA和RNA。每种靶标在正常细胞功能和疾病进程中起到重要作用并且需要特定的样品制备物，其不必与所有靶标相容。在相同样品中的原位检测将允许更好地测定这些不同靶标的表达之间的相关性和更好地分析它们与疾病的关系。
[0005]简述
本文公开的是探测生物样品中的多种靶标的新方法，其中所述靶标是DNA、RNA和蛋白质。
[0006]在某些实施方案中，公开了包括多个步骤的探测生物样品中的多种靶标的方法。所述步骤包括使用与RNA靶标直接或间接结合的标记的核酸探针，使所述样品经历原位杂交反应，观察来自与RNA靶标结合的标记的探针的信号，和任选地去除来自所述标记的探针的信号。所述方法进一步包括使所述样品经历抗原修复方案的步骤，以修复所述样品的蛋白质表位，使用基于抗体的方法使所述样品经历原位杂交反应并将一种或多种抗体探针与所述样品上的抗原结合，观察来自所述一种或多种抗体探针的信号，去除来自所述抗体探针的信号，任选地应用蛋白酶处理以接近所述样品的DNA靶标，使用直接或间接标记所述样品的一种或多种DNA靶标的标记的核酸探针使所述样品经历原位杂交反应，观察来自所述标记的DNA靶标的信号，和任选地去除来自一种或多种标记的DNA靶标的信号。
[0007]在某些实施方案中，所述方法进一步包括用一种或多种对照探针对所述样品染色以允许记录样品的多个图像和任选地记录样品的多个图像。再其它实施方案包括根据多个图像来分析蛋白质、RNA和DNA的表达的方法。
[0008]附图描述
图1是探测生物样品中的多种靶标的方法的示意图，其中所述靶标包括RNA、DNA和蛋白质。
[0009]图2a显示II级肺鳞状细胞癌的多重RNA、蛋白质和DNA染色，A:细胞核用DAPI染色，B: U6 RNA, C: EGFR, D:细胞角蛋白 7，E:1GF1R, F: NaKATP 酶，G: cMET 和 H:EGFR0
[0010]图2b，图组I & J是图2a的图组G & H的相同视野切片的放大:未观察到明显的cMET染色。
[0011]图3a显示肺转移性腺癌的多重RNA、蛋白质和DNA染色。A:细胞核用DAPI染色，B: U6 RNA, C: EGFR, D:细胞角蛋白 7，B:1GF1R, F: NaKATP酶，G: cMET和H: EGFR0
[0012]图3b，图组I & J是图3a的图组G & H的相同视野切片的放大。
[0013]发明详述
为更清楚和简明地阐述并指出所要求保护发明的主题，对下文描述和所附权利要求书中使用的特定术语提供了以下定义。
[0014]单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数对象，除非上下文中另有明确说明。本文贯穿说明书和权利要求书所用的近似措辞，可应用于修饰任何数量表示，这些数量表示在不导致对其涉及的基本功能改变的情况下可允许变化。因此，由术语例如“约”修饰的值并不限于所指定的精确值。除非另有说明，在说明书和权利要求书中所用的表示成分、特性例如分子量、反应条件等等的量的所有数字应理解为在所有的情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在以下说明书和所附权利要求书中提及的数字参数都是近似值，其可根据本发明试图获得的所需特性而变化。至少各个数字参数应至少根据所报告的有效数字的位数并通过应用普通的四舍五入技术来解释。
[0015]本文使用的术语“抗体”是指与另一分子的特定空间和极性组构特异性地结合并由此定义为与其互补的免疫球蛋白质。抗体可以是单克隆或多克隆的并可通过本领域熟知的技术制备，所述技术例如使宿主免疫并收集血清(多克隆)，或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌的蛋白质(单克隆)，或通过克隆和表达编码至少天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其突变形式。抗体可包括完全的免疫球蛋白质或其片段，所述免疫球蛋白质包括各种类型和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgGU IgG2a、IgG2b和IgG3、IgMo功能性抗体片段可包括能够保持以类似于全长抗体的亲和力结合的抗体部分(例如，Fab、Fv和F(aV )2或？&13’)。此外，在合适时，可以使用免疫球蛋白质或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要能基本上维持对特定分子的结合亲和力。
[0016]本文使用的术语“结合剂”是指可结合生物样品中的一种或多种靶标的分子。结合剂可与靶标特异性地结合。合适的结合剂可包括一种或多种天然的或修饰的肽、蛋白质(例如，抗体、亲和体(affibodies)或适体)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或适体)；多糖(例如，凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原或半抗原。合适的结合剂可根据待分析的样品和可供检测之用的靶标进行选择。例如，样品中的靶标可包括配体且结合剂可包括受体，或者靶标可包括受体且结合剂可包括配体。类似地，靶标可包括抗原并且结合剂可包括抗体或抗体片段，或者反之亦然。在一些实施方案中，靶标可包括核酸并且结合剂可包括互补的核酸。在一些实施方案中，靶标和结合剂两者可包括能够彼此结合的蛋白质。
[0017]本文使用的术语“生物样品”是指得自生物受试者的样品，包括在体内或体外获得的生物组织或液体来源的样品。这样的样品可以是但不限于从哺乳动物(包括人)分离的体液(例如，血、血浆、血清或尿)、器官、组织、级分和细胞。生物样品还可包括生物样品的切片，包括组织的切片(例如，器官或组织的切片部分)。生物样品还可包括来自生物样品的提取物，例如来自生物液体(例如，血或尿)的抗原。
[0018]生物样品可以是原核来源或真核来源(例如，昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬行动物)。在一些实施方案中，生物样品是哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、牛、狗、驴、豚鼠或兔)。在某些实施方案中，生物样品具有灵长类动物来源(例如，黑猩猩或人)。
[0019]本文使用的术语“探针”是指具有结合剂和标记(例如信号发生器或酶)的试剂。在一些实施方案中，结合剂和标记(信号发生器或酶)包含在单一实体中。结合剂和标记可直接连接(例如，经由结合到结合剂中的荧光分子)或间接连接(例如，通过接头，其可包括切割位点)并以单一步骤应用于生物样品。在备选的实施方案中，结合剂和标记包含在分开的实体(例如，能够结合靶标和酶的第一抗体或者能够结合第一抗体的信号发生器-标记的第二抗体)中。当结合剂和标记(信号发生器或酶)是分开的实体时，它们可以单一步骤或多个步骤应用于生物样品。本文使用的术语“荧光探针”是指具有偶联于荧光信号发生器的结合剂的试剂。
[0020]本文使用的术语“信号发生器”是指能够使用一种或多种检测技术(例如，光谱测定法、热量测定法、光谱法或肉眼检查)提供可检测的信号的分子。可检测的信号的合适实例可包括光信号和电信号、或放射性信号。信号发生器的实例包括发色团、荧光团或拉曼-活性标签或放射性标记中的一个或多个。如上所述，关于探针，在某些实施方案中信号发生器和结合剂可存在于单一实体(例如，含有荧光标记的靶标结合蛋白)中。或者，结合剂和信号发生器可以是在引入样品之前或之后彼此缔合的分开的实体(例如，受体蛋白和针对该特定受体蛋白的标记的抗体)。
[0021]本文使用的术语“对照探针”是指具有与信号发生器偶联的结合剂或能够直接染色的信号发生器的试剂，以致信号发生器在与用于灭活荧光探针的信号灭活剂溶液接触后保留至少80%的信号。对照探针中的合适的信号发生器当与信号灭活剂接触时，基本上不被灭活。信号发生器的合适实例可包括放射性标记或非氧化的荧光团(例如，DAPI)。
[0022]本文使用的术语“酶”是指能催化底物的化学反应的蛋白质分子。在一些实施方案中，合适的酶催化底物的化学反应，形成能结合于存在于样品或样品所结合的固体支持物中的受体(例如，酚基)的反应产物。受体可以是外源性的(即，受体非固有地粘附于样品或固体-支持物)或内源性的(受体固有地存在于样品或固体支持物中)。合适的酶的实例包括过氧化物酶、氧化酶、磷酸酯酶、酯酶和糖苷酶。合适的酶的具体实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β -D-半乳糖苷酶、脂肪酶和葡糖氧化酶。
[0023]本文使用的术语“酶底物”是指被酶化学催化以形成反应产物的化合物。在一些实施方案中，反应产物能够结合存在于样品或样品所结合的固体支持物中的受体。在一些实施方案中，本文方法中使用的酶底物可包括非-发色的或非-化学发光的底物。信号发生器可与酶底物连接作为标记。
[0024]本文使用的术语“发色团”是指分子的一部分，其中两个不同分子轨道之间的能量差异落入可见光谱的范围内。发色团可为造成分子颜色的原因，所述分子颜色受到某波长的可见光的吸光度或者其它波长的透光率或反射率的影响。
[0025]本文使用的术语“荧光团”或“荧光信号发生器”是指当通过暴露于特定波长的光激发时，发射不同的波长的光的化合物。荧光团可根据其发射特征或“颜色”进行描述。绿色焚光团(例如Cy3、FITC和俄勒同绿(Oregon Green))的特征可在于其以通常在515-540纳米范围内的波长发射。红色荧光团(例如得克萨斯红(Texas Red)、Cy5和四甲基罗丹明)的特征可在于其以通常在590-690纳米范围内的波长发射。荧光团的实例包括但不限于，4-乙酰氨基_4’-异硫氰酸根合苗(isoth1cyanatostilbene)-2, 2' 二磺酸、卩丫啶、卩丫啶和吖啶异硫氰酸酯的衍生物、5-(2’ -氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺_3，5 二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)、N_ (4_苯胺基_1_萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、亮黄(Brilliant Yellow)、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、Coumarin 120)、7_氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)、焰红染料(cyanosine) ;4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚(DAPI)、5’，5’ ’ - 二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)、7_ 二乙基氨基-3-(4’ -异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素、-4，4’ - 二异硫氰酸根合二氢-芪_2，2’ - 二磺酸、4，4’ - 二异硫氰酸芪_2，2’ - 二磺酸、5-[ 二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)、曙红、曙红衍生物例如异硫氰酸曙红、赤藓红、赤藓红衍生物例如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；溴乙啶(ethidium);荧光素和衍生物例如5-羧基荧光素(FAM)、5- (4，6- 二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’ 7’ - 二甲氧基-4’ 5’ - 二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、QFITC (XRITC);荧光胺衍生物(与胺反应时发荧光)；IR144 ;IR1446 ;异硫氰酸孔雀绿；4_甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酸红、B-藻红蛋白质；邻苯二甲醛衍生物(与胺反应时发荧光)；芘和衍生物例如芘、丁酸芘和1-芘丁酸琥珀酰亚胺基酯；活性红4 (Cibacron.RTM.亮红3B-A)、罗丹明和衍生物例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6_羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克萨斯红)；N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA);四甲基罗丹明、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC);核黄素；玫红酸和镧系元素螯合物衍生物、量子点、花菁、pyrelium染料和方酸菁(squaraines)。
[0026]本文使用的术语“原位”通常指在原始位置例如在完整的器官或组织或者在器官或组织的代表性片段中发生的事件。在一些实施方案中，靶标的原位分析可在从多种来源获得的细胞上进行，所述来源包括生物体、器官、组织样品或细胞培养物。原位分析提供情境信息(contextual informat1n)，而这样的信息在将革E标从其起源部位移出时可能会丧失。因此，靶标的原位分析描述了位于全细胞或组织样品中的靶标-结合的探针的分析，而不管靶标-结合的探针保留在细胞内时细胞膜是否完全完整或是部分地完整。此外，本文公开的方法可用于原位分析固定的或未固定的细胞或组织样品中的靶标。
[0027]本文使用的术语信号灭活剂是指可直接灭活信号或在灭活剂存在时照射样品之后灭活信号的化学物。
[0028]本文使用的术语“照射”或“辐射”是指样品或溶液暴露于非-电离辐射的作用或过程。在一些实施方案中，非-电离照射具有350 11111和1.3 μπι之间的波长。在优选的实施方案中，非-电离辐射是400-700 nm波长的可见光。照射可通过使样品或溶液暴露于辐射源例如能够发射某一波长或一定范围波长的辐射的灯而实现。在一些实施方案中，能够经历光激发的分子因照射而被光激发。在一些实施方案中，能够经历光激发的分子是信号发生器，例如，荧光信号发生器。在一些实施方案中，荧光信号发生器的照射启动荧光信号发生器和信号灭活剂之间的光反应。在一些实施方案中，照射启动通过光活化化学漂白而基本上灭活信号发生器的光反应。在其它实施方案中，信号灭活剂经历光激发以产生反应性部分，其与信号发生器反应以灭活信号。光学滤波器可用于将样品或溶液的照射限制于某一特定波长或一定范围的波长。在一些实施方案中，光学滤波器可用于将照射限制在窄范围的波长，以选择性光激发能够经历光激发的一个或多个分子。术语“选择性光激发”指一种作用或过程，藉此使能够经历光激发的一个或多个分子在能够经历光激发的一个或多个其它分子(其在照射后保持在基础电子状态)的存在下被光激发。
[0029]在某些实施方案中，能够经历光激发的分子是荧光染料，例如，花菁染料。在一个进一步的实施方案中，采用限制在620-680 nm之间的波长范围的照射以选择性光激发Cy5染料。在备选的实施方案中，以特定波长照射样品也可通过使用激光来实现。
[0030]本文使用的术语“过氧化物酶”是指催化酶底物与电子供体一起的氧化反应的一类酶。过氧化物酶的实例包括辣根过氧化物酶、细胞色素C过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、微过氧