一种云芝发酵液中多糖含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种云芝发酵液中多糖含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]多糖类不仅是生物体必不可少的成分，而且还具有多种药理活性，如香菇多糖、灵芝多糖等具有抗肿瘤作用，黄芪多糖和人参多糖具有增强免疫作用。多糖通常由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖等聚合而成。糖类在强无机酸中可脱水生成醛类，可和各种酚类产生特有有色物质。多糖在浓硫酸作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，可通过比色法测定多糖含量。因此，目前常可采用苯酚-硫酸法来测定多糖类含量。但是在采用该法测定过程中，对有色样品结果易偏高。云芝又称为采绒革盖菌、千层蘑、彩云革盖菌等，隶属真菌门、担子菌亚门、多孔菌科、革盖菌属，是一种分布广泛的大型木腐真菌。云芝多糖是云芝的主要有效成分，具有多种生物活性，能激活免设细胞、提高机体免疫功能，抗肿瘤、降血脂及抗菌，此外，云芝多糖对慢性应激引起的学习和记忆障碍等均有显著的改善效果，近年来，多糖作为保健食品主要成分已悄然兴起，对其生物活性的研究也日益增加和深入。
[0003]目前，人们从云芝菌子实体中提取云芝多糖，并加工成各类制剂，对其中云芝多糖含量的测量是衡量该制剂质量的主要标准之一，但云芝多糖成分复杂，目前，苯酚-硫酸法测定也存在一定缺陷。为此，本发明在传统的苯酚-硫酸法的基础上作了改进，可明显提高云芝多糖含量测定的准确性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对上述现有技术中存在的缺陷提供一种改良的云芝发酵液中多糖含量的测定方法。
[0005]本发明的技术方案如下:
一种云芝发酵液中多糖的含量测定方法，包括以下步骤:
(O配制葡萄糖标准溶液:取200mg的干燥的葡萄糖置于10ml容量瓶中，定容摇匀，取Iml置入50ml容量瓶中定容摇匀，分别吸取0.4,0.6,0.8、1.0、1.2ml，用蒸馏水补充至2ml，加入苯酚溶液1ml，静置10_20min，摇匀，室温下放置20_30min，在490nm处测吸光度，根据朗伯比尔定律求得光被吸收的比例系数k。
[0006](2)样品预处理:取云芝3_5g冷冻干燥至恒重，粉碎过筛，取筛下样品粉末进行超微粉碎待用；
(3)菌种培养活化:取步骤(I)中制得的超微粉碎后样品粉末置入斜面培养基中进行培养，得到活化的菌株；
(4)摇瓶发酵培养:取步骤(2)中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，得菌株发酵液； (5)多糖提取:将步骤(3)中制得的菌株发酵液加等量的蒸馏水进一步溶解稀释，置入恒温水浴条件下加热,过滤，取滤液浓缩,滤渣中加入等量蒸馏水溶解进行恒温水浴,合并滤液过滤，取滤液
加热浓缩，冷却，将溶液转至离心管中，加入无水乙醇40-60ml离心，弃上清液，残渣采用80%-85%的乙醇洗涤3-5次，取残渣备用；
(6)多糖含量测定:取步骤(5)中的残渣，加2-5ml苯酚-硫酸溶液溶解，加蒸馏水定容至10ml,取2_5ml置于25ml比色管中，加入苯酹-硫酸溶液l_3ml,沸水水浴2_5min,冷却后静置10-20min，摇匀，室温下放置20_30min，在490nm处测吸光度，计算云芝多糖含量。
[0007]优选的，步骤(2)中所述的粉碎过筛为过40-80目筛，。
[0008]优选的，步骤(3)中所述的斜面培养基的组分为:马铃薯15-25%，葡萄糖1_3%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁水合物0.1-0.3%，琼脂1-3%。
[0009]优选的，步骤(4)中所述的摇瓶发酵培养基的组分为:马铃薯汁30-50%，葡萄糖1-3%,硫酸镁水合物0.1-0.3%，硫酸钠0.03-0.08%，磷酸二氢钾0.1-0.5%。
[0010]优选的，步骤(3)中所述的斜面培养基及步骤(4)中所述的摇瓶种子培养基均为在121°C条件下湿热灭菌30-40min的培养基。
[0011]优选的，步骤(3)中所述的培养条件为:培养温度25_28°C，培养时间3_5d。
[0012]优选的，步骤(4)中所述的培养条件为:摇床速度200-220r/min，培养温度25-28°C，培养时间 3-5d。
[0013]优选的，步骤(5)中所述的恒温水浴温度为90_95°C。
[0014]优选的，步骤(6)中所述的苯酚-硫酸溶液中，苯酚与硫酸的体积比为(1-1.5):(10-13)。
[0015]步骤(6)中所述的云芝多糖的计算的具体公式为:C=A/kd，C:云芝多糖浓度；A:吸光度；k:光被吸收的比例系数；d:光程。
[0016]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:
1.本发明中3.本发明在对云芝中多糖进行提取时，先后对样品进行预处理、斜面培养基培养及摇瓶发酵培养，保证了多糖提取更加充分。
[0017]2.本发明采用苯酚-硫酸法测定云芝发酵液中多糖含量，操作简单，重复性好，且云芝多糖在采用苯酚显色后30min内吸光度非常稳定，本发明中在对样品采用苯酚显色后，静置10-20min，摇匀后室温下放置20_30min，保证了显色反应更加充分，继而保证了吸光度测定的准确性。
【具体实施方式】
[0018]本发明通过以下具体实施例更详细的说明本发明，可以使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0019]实施例1
一种云芝发酵液中多糖的含量测定方法，包括以下步骤:
(O配制葡萄糖标准溶液:取200mg的干燥的葡萄糖置于10ml容量瓶中，定容摇匀，取Iml置入50ml容量瓶中定容摇匀，分别吸取0.4,0.6,0.8、1.0、1.2ml，用蒸馏水补充至2ml,加入苯酹溶液Iml,静置1min,摇勻，室温下放置20min,在490nm处测吸光度,根据朗伯比尔定律求得光被吸收的比例系数k。
[0020](2)样品预处理:取云芝3g冷冻干燥至恒重，粉碎过40目筛，取筛下样品粉末进行超微粉碎待用；
(3)菌种培养活化:取步骤(I)中制得的超微粉碎后样品粉末置入斜面培养基中进行培养，培养温度25°C，培养时间3d，得到活化的菌株；
(4)摇瓶发酵培养:取步骤(2)中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，摇床速度200r/min，培养温度25°C，培养时间3d，得菌株发酵液；
(5)多糖提取:将步骤(3)中制得的菌株发酵液加等量的蒸馏水进一步溶解稀释，置入90°C的恒温水浴条件下加热，过滤，取滤液浓缩，滤渣中加入等量蒸馏水溶解后在90°C下进行恒温水浴，合并滤液过滤，取滤液加热浓缩，冷却，将溶液转至离心管中，加入无水乙醇40ml离心，弃上清液，残渣采用80%的乙醇洗涤3次，取残渣备用；
(6)多糖含量测定:取步骤(5)中的残渣，加2ml苯酚-硫酸溶液溶解，加蒸馏水定容至100ml,取2ml置于25ml比色管中，加入苯酹-硫酸溶液Iml,沸水水浴2min,冷却后静置1min,摇勻，室温下放置20min,在490nm处测吸光度,计算云芝多糖含量。
[0021]步骤(3)中所述的斜面培养基的组分为:马铃薯15%，葡萄糖1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁水合物0.1%，琼脂1%。
[0022]步骤(4)中所述的摇瓶发酵培养基的组分为:马铃薯汁30%，葡萄糖1%，硫酸镁水合物0.1%，硫酸钠0.03%，磷酸二氢钾0.1%。
[0023]步骤(3)中所述的斜面培养基及步骤(4)中所述的摇瓶种子培养基均为在121°C条件下湿热灭菌30min的培养基。
[0024]步骤(6)中所述的苯酚-硫酸溶液中，苯酚与硫酸的体积比为1: 10。
[0025]步骤(6)中所述的云芝多糖的计算的具体公式为:C=A/kd，C:云芝多糖浓度；A:吸光度；k:光被吸收的比例系数；d:光程。
[0026]实施例2
一种云芝发酵液中多糖的含量测定方法，包括以下步骤:
(O配制葡萄糖标准溶液:取200mg的干燥的葡萄糖置于10ml容量瓶中，定容摇匀，取Iml置入50ml容量瓶中定容摇匀，分别吸取0.4,0.6,0.8、1.0、1.2ml，用蒸馏水补充至2ml,加入苯酹溶液Iml,静置20min,摇勻，室温下放置30min,在490nm处测吸光度,根据朗伯比尔定律求得光被吸收的比例系数k。
[0027](2)样品预处理:取云芝5g冷冻干燥至恒重，粉碎40-80目过筛，取筛下样品粉末进行超微粉碎待用；
(3)菌种培养活化:取步骤(I)中制得的超微粉碎后样品粉末置入斜面培养基中进行培养，培养温度28°C，培养时间5d，得到活化的菌株；
(4)摇瓶发酵培养:取步骤(2)中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，摇床速度2