待测蛋白质的修饰程度，即类泛素化修饰多聚链的聚合 度。
[0052] 优选地，所述步骤（5)对英光标记后的经类泛素化修饰的待测蛋白质进行检测和 量化分析的方法为；利用全内反射英光显微镜对经类泛素化修饰的待测蛋白质进行单分子 成像，观察待测蛋白质是否发生类泛素化修饰；然后将带单四半脫氨酸多肤标签的类泛素 化修饰蛋白的英光强度的平均值定义为单类泛素化修饰，再将经类泛素化修饰的待测蛋白 质获得的英光强度值除W单修饰的英光值，从而计算出经类泛素化修饰的待测蛋白质的修 饰程度，即类泛素化修饰多聚链的聚合度。
[0053] 优选地，所述带单四半脫氨酸多肤标签的类泛素化修饰蛋白中，所述单四半脫氨 酸多肤标签位于所述类泛素化修饰蛋白的N端。
[0054] 本发明所述的带单四半脫氨酸多肤标签的类泛素化修饰蛋白即单个四半脫氨酸 多肤标签与类泛素样修饰蛋白的融合蛋白。
[0055] 本发明提供的蛋白质类泛素化修饰的检测方法，通过将类泛素化修饰蛋白与四半 脫氨酸多肤标签融合，借助四半脫氨酸多肤标签与双神英光染料之间特意性的反应，即双 神英光染料共价结合四半脫氨酸多肤标签而发出英光，从而将类泛素化修饰和/或多聚类 泛素化修饰该一生物学事件转变为可见的英光信号，并结合全内反射英光显微镜的单分子 检测能力实现类泛素化修饰的灵敏检测和多聚类泛素化修饰的量化分析。
[0056] 第二方面，本发明提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测质粒，含有相连的类泛 素化修饰蛋白的编码基因和四半脫氨酸多肤标签的编码基因，所述四半脫氨酸多肤标签的 编码基因位于所述类泛素化修饰蛋白的编码基因的5'端，所述四半脫氨酸多肤标签的编码 基因为18bp~36bp ;
[0057] 所述四半脫氨酸多肤标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半脫氨酸，所 述X为除半脫氨酸W外的任一氨基酸。
[005引优选地，检测质粒为将所述相连的类泛素化修饰蛋白的编码基因和四半脫氨酸多 肤标签的编码基因插入原核载体或真核载体的多克隆位点后所得的重组质粒。
[0059] 进一步优选地，所述原核载体或真核载体为原核表达载体或真核表达载体。
[0060] 更进一步优选地，所述原核表达载体为祀T载体或pGEX载体。
[0061] 更进一步优选地，所述真核表达载体为pcDNA载体。
[00間更进一步优选地，所述 pcDNA 载体为 pcDNA ?3. 1 (+)、pcDNA ?3. 1 (-)、pcDNA?3. 1/ His-A、pcDNA?3. 1/His-B 或 pcDNA?3. 1/His-C 载体。
[006引更进一步优选地，所述多克隆位点为pcDNA?3. 1/His-A的化nd III和化o I酶切 位点。
[0064] 优选地，所述类泛素化修饰蛋白为SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、肥孤8、FATIO、 FUBUUBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2。
[0065] 优选地，所述SUM02为人源SUM02 (h SUM02)，所述人源SUM02 (h SUM02)的编码 基因如SEQ ID N0:1所示。
[0066] 在此优选条件下，所述类泛素化修饰蛋白的Genebank登录号如下：
[0067]所述 SUM01、SUM03、SUM04、肥孤8、FAT10、FUB1、UBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2 的 Genebank 登录号分别为 BC006462. 1、NM_001286416. 1、AB205057. 1、BC104201. 1、 AF123050. 1、NM_001997. 4、AF313915. 1、NM_005101. 3、BC005193. 1、BC003581. 1、 AB017507. 1 ；
[0068]优选地，所述待测蛋白质为 Sp100 、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-^n、An^ogen receptor、]Vklm2、TopoI、TopoII、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66。
[0069]在此优选条件下，所述 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、An化ogen receptor、]Vklm2、TopoI、Top〇n、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66 的 Genebank 登录号分别为 BC011562. 1、BC003596. 1、Y11416. 1、BC041396. 2、S50913. 1、AF326592. 1、BC068522. 1、 M：M233. 1、NM_001145339. 2、BC136297. UJ04088. UAF091214. UM91463. 1、NM_003211.4、 匪_003592. 2、AF126404. 1、BC092409. 1、AF077188. 1、BC144136. 1、NM_002227. 2、 GU211：M7. 1、X60188. 1、AF281255. 1、U65410. 1、AY441957. 1、J04718. 1、NM_020666. 2、 NM_005146. 4。
[0070] 优选地，本发明所采用四半脫氨酸多肤标签包括的CCXXCC为序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0071]优选地，所述 CCXXCC 为 CCPGCC。
[0072] 优选地，所述四半脫氨酸标签多肤的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 所示。
[0073]具体地，所述 SEQ ID N0:3 的序列为 FLNCCPGCCMEP。
[0074]具体地，所述 SEQ ID N0:4 的序列为 HRWCCPGCCKTF。
[0075] 第H方面，本发明提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测质粒的制备方法，包括 如下步骤：
[0076] (1)、提供类泛素化修饰蛋白编码基因的PCR扩增模板；
[0077] (2)、提供类泛素化修饰蛋白编码基因的PCR扩增引物，包括上游引物和下游引 物，其中，所述上游引物具有四半脫氨酸多肤标签的编码基因序列，所述四半脫氨酸多肤标 签的编码基因序列为18bp~36bp;
[0078] 所述四半脫氨酸多肤标签的氨基酸序列包括CCXXCC,其中，所述C为半脫氨酸，所 述X为除半脫氨酸W外的任一氨基酸；
[0079] (3)、采用步骤（2)提供的PCR扩增引物与步骤（1)提供的基因模板进行PCR，扩增 得到编码带四半脫氨酸多肤标签的类泛素化修饰蛋白的融合基因；
[0080] (4)、将扩增后所得的融合基因插入到载体的多克隆位点，得到检测质粒，所述检 测质粒含有相连的类泛素化修饰蛋白的编码基因和四半脫氨酸多肤标签的编码基因，所述 四半脫氨酸多肤标签的编码基因位于所述类泛素化修饰蛋白的编码基因的5'端，所述四半 脫氨酸多肤标签的编码基因为18bp~36bp，
[0081] 所述四半脫氨酸多肤标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半脫氨酸，所 述X为除半脫氨酸W外的任一氨基酸。
[008引优选地，所述步骤（2)中，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID N0:5和 SEQ ID N0:6 所示。
[0083] 具体地，SEQ ID NO: 5所示的序列为（5, -3'）；
[0084] GCAAGCTTACCATGGGATTCTTGAACTGTTGCCCGGGCTGCTGTATGG AACCAATGGCCGACGAAAAGCCCAAGGAAGG ；
[0085] 具体地，SEQ ID NO:6所示的序列为（5' -3，）；
[0086] CGCTCGAGTCAACCTCCCGTCTGCTGTT。
[0087] 在SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6中，单下划线标识部分为酶切位点，双下划线标识 部分为四半脫氨酸多肤标签的编码基因。
[0088] 优选地，所述步骤（4)中，所述载体为原核表达载体或真核表达载体。
[0089] 进一步优选地，所述原核表达载体为pET载体或pGEX载体。
[0090] 进一步优选地，所述真核表达载体为pcDNA载体。
[0091] 进一步优选地，所述 pcDNA 载体为 pcDNA ?3. 1 (+)、pcDNA ?3. 1 (-)、pcDNA?3. 1/ His-A、pcDNA?3. 1/His-B 或 pcDNA?3. 1/His-C 载体。
[009引在此优选条件下，所述多克隆位点优选为pcDNA?3. 1/His-A的化nd III和化o I 酶切位点。
[0093] 优选地，所述类泛素化修饰蛋白为SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、肥孤8、FATIO、 FUBUUBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2。
[0094] 优选地，所述SUM02为人源SUM02 (h SUM02)，所述人源SUM02的编码基因如SEQ ID NO: 1 所示。
[0095] 在此优选条件下，所述类泛素化修饰蛋白的Genebank登录号如下：
[0096] 所述 SUM01、SUM03、SUM04、肥孤8、FAT10、FUB1、UBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2 的 Genebank 登录号分别为 BC006462. 1、NM_001286416. 1、AB205057. 1、BC104201. 1、 AF123050. 1、NM_001997. 4、AF313915. 1、NM_005101. 3、BC005193. 1、BC003581. 1、 AB017507. 1 ；
[0097] 优选地，所述待测蛋白质为 Sp100 、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-^n、ArKlrogen receptor、]Vklm2、TopoI、TopoII、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66。
[0098] 在此优选条件下，所述 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、An化ogen receptor、]Vklm2、TopoI、Top〇n、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66 的 Genebank 登录号分别为 BC011562. 1、BC003596. 1、Y11416. 1、BC041396. 2、S50913. 1、AF326592. 1、BC068522. 1、 M：M233. 1、NM_001145339. 2、BC136297. UJ04088. UAF091214. UM91463. 1、NM_003211.4、 匪_003592. 2、AF126404. 1、BC092409. 1、A