TGCTGTT。
[0159] 优选地，所述带单四半脫氨酸多肤标签的类泛素化修饰蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:9 所示。
[0160] 本发明提供了的蛋白质类泛素化修饰的检测方法、检测质粒W及制备方法、检测 试剂盒具有如下有益效果：
[0161] (1)本发明提供的蛋白质类泛素化修饰的检测方法，通过将类泛素化修饰蛋白与 四半脫氨酸多肤标签融合，借助四半脫氨酸多肤标签与双神英光染料之间特意性的反应， 对待测蛋白质是否发生类泛素化修饰进行检测，W及对多聚类泛素化修饰的修饰程度进行 量化分析；
[0162] (2)本发明提供的蛋白质类泛素化修饰的检测方法灵敏度高，操作简单；
[0163] (3)此外，本发明提供了的蛋白质类泛素化修饰的检测质粒、检测试剂盒制备简 单，成本较低。
【附图说明】
[0164] 图1为本发明实施例1制得的重组表达质粒pcDNA?3. 1-4切s-hSUM02进行双酶切 后的琼脂糖凝胶电泳图；
[0165] 图2为本发明实施例2纯化后的4切s-hSUM02融合蛋白的考马斯亮蓝染色结果；
[0166] 图3为本发明实施例2制得的4切s-hSUM02融合蛋白的单分子成像结果；
[0167] 图4为本发明实施例3制得的Sp 100蛋白在正常生理状况下在肥K293T细胞中发 生小泛素样修饰的单分子成像结果；
[016引图5为本发明实施例3制得的Sp 100蛋白在用双氧水处理情况下在肥K293T细胞 中发生小泛素样修饰的单分子成像结果；
[0169] 图6为本发明实施例3和4计算出的Sp 100蛋白在正常生理条件下在肥K293T细 胞中发生多聚小泛素样修饰的量化分析结果；
[0170] 图7为本发明实施例3和4计算出的Sp 100蛋白在用双氧水处理情况下在肥K293T 细胞中发生多聚小泛素样修饰的量化分析结果。
【具体实施方式】
[0171] W下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0172] 下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook, J. , Russell, David W. , Molecular Cloning:A L油oratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物由 宝生物工程(大连）有限公司合成。
[017引本发明实施例所使用的载体pcDNA?3. 1/His A、所使用的菌株D册a和化21 0E3) 购自invitrogen公司，细胞株肥K293T购自ATCC，所使用的试剂均为市售商品。
[0174] 本发明优选W蛋白质的小泛素样修饰为例，提供了如下实施例1~4 :
[0175] 实施例1
[017引一种小泛素样修饰蛋白-2 (small ubiquitin-l;Lke modifiers, SUM02)与四半脫 氨酸多肤标签（4切s)融合基因表达质粒的构建方法，包括W下步骤：
[0177] (1)扩增四半脫氨酸多肤标签-人源小泛素样修饰蛋白-2融合基因 (4Cys-hSUM02)
[0178] WSEQ ID N0:1为模板，采用SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的引物进行PCR扩 增人源小泛素样修饰蛋白-2的编码基因（hSUM02,所述hSUM02的编码基因如SEQ ID NO: 1 所示)，扩增条件为：
[0179] PCR 反应体系为（lOOy l);l〇XBufferlOy l、dNTP mix8y 1、DNA 模板 ly LI'aq 酶1 y 1、引物混合物2y 1、双蒸水78y 1 ;
[0180]反应参数为；95°C 3min、95°C 30s、58°C 30s、72°C 30s 共 30 个循环，最后再 72°C延 伸 5min。
[018。 然后采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送至宝生物工程(大连）有限公 司测序。
[0182] (2)含4切s-hSUM02的重组表达质粒pcDNA?3. 1-4切s-hSUM02的构建
[018引 1. 4切s-hSUM02融合基因和pcDNA?3. 1/His A载体的双酶切；
[0184]取pcDNA?3. 1/His A载体，将步骤（1)扩增所得到的4切s-hSUM02融合基因和 pcDNA?3. 1/化8 A载体利用相同的酶分别进行酶切反应，酶切体系分别如下：
【主权项】
1. 一种蛋白质类泛素化修饰的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提供重组质粒，包括待测蛋白质表达质粒和检测质粒， 其中，所述待测蛋白质表达质粒具有待测蛋白质的编码基因，所述检测质粒含有相连 的类泛素化修饰蛋白的编码基因和四半胱氨酸多肽标签的编码基因，所述四半胱氨酸多肽 标签的编码基因位于类泛素化修饰蛋白的编码基因的5'端，所述四半胱氨酸多肽标签的编 码基因为18bp~36bp， 所述四半胱氨酸多肽标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半胱氨酸，所述X 为除半胱氨酸以外的任一氨基酸， 所述待测蛋白质为类泛素化修饰蛋白作用的底物蛋白； (2) 将所述待测蛋白表达质粒和检测质粒在细胞内共表达，得到经类泛素化修饰的待 测蛋白质； (3) 纯化经类泛素化修饰蛋白修饰的待测蛋白质； (4) 采用双砷荧光染料对纯化后的经类泛素化修饰的待测蛋白质进行荧光标记； (5) 对荧光标记的经类泛素化修饰的待测蛋白质进行检测和/或量化分析。
2. 如权利要求1所述的蛋白质类泛素化修饰的检测方法，其特征在于，所述类泛素化 修饰蛋白为 SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、NEDD8、FAT10、FUBl、UBL5、ISG15、UFMl、Urml 或 Apgl2。
3. 如权利要求1所述的蛋白质类泛素化修饰的检测方法，其特征在于，所述待测蛋白 质为 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、Androgen receptor、Mdm2、Topo I、 Topo II、WRN、glut4、TDG、Cul-l、Cul-2、Cul-3、Cul-4A、PLCYl、JAKl、STAT-l、ERKl、Bcl-G、 Mad2、Sp3、PCNA、CLK4 或 Snu66。
4. 一种蛋白质类泛素化修饰的检测质粒，其特征在于，含有相连的类泛素化修饰蛋 白的编码基因和四半胱氨酸多肽标签的编码基因，所述四半胱氨酸多肽标签的编码基因 位于所述类泛素化修饰蛋白的编码基因的5'端，所述四半胱氨酸多肽标签的编码基因为 18bp ~36bp ; 所述四半胱氨酸多肽标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半胱氨酸，所述X 为除半胱氨酸以外的任一氨基酸。
5. 如权利要求4所述的蛋白质类泛素化修饰的检测质粒，其特征在于，所述类泛素化 修饰蛋白为 SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、NEDD8、FAHO、FUBl、UBL5、ISG15、UFMl、Urml 或 Apgl2。
6. 如权利要求4所述的蛋白质类泛素化修饰的检测质粒，其特征在于，所述待测蛋白 质为 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、Androgen receptor、Mdm2、Topo I、 Topo II、WRN、glut4、TDG、Cul-I、Cul-2、Cul-3、Cul-4A、PLC YI、JAKl、STAT-I、ERKl、Bcl-G、 Mad2、Sp3、PCNA、CLK4 或 Snu66。
7. -种蛋白质类泛素化修饰检测质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 、提供类泛素化修饰蛋白编码基因的PCR扩增模板； (2) 、提供类泛素化修饰蛋白编码基因的PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物，其 中，所述上游引物具有四半胱氨酸多肽标签的编码基因序列，所述四半胱氨酸多肽标签的 编码基因序列为18bp~36bp ; 所述四半胱氨酸多肽标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半胱氨酸，所述X 为除半胱氨酸以外的任一氨基酸； (3)、采用步骤（2)提供的PCR扩增引物与步骤（1)提供的基因模板进行PCR，扩增得到 编码带四半胱氨酸多肽标签的类泛素化修饰蛋白的融合基因； (4) 、将扩增后所得的融合基因插入到载体的多克隆位点，得到检测质粒，所述检测质 粒含有相连的类泛素化修饰蛋白的编码基因和四半胱氨酸多肽标签的编码基因，所述四半 胱氨酸多肽标签的编码基因位于所述类泛素化修饰蛋白编码基因的5'端，所述四半胱氨酸 多肽标签的编码基因为18bp~36bp， 所述四半胱氨酸多肽标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半胱氨酸，所述X 为除半胱氨酸以外的任一氨基酸。
8. 如权利要求7所述的蛋白质类泛素化修饰的检测质粒的制备方法，其特征在于，所 述类泛素化修饰蛋白为 SUMO I、SUM02、SUM03、SUM04、NEDD8、FAT IO、FUBI、UBL5、I SG 15、UFM1、 Urml 或 Apgl2〇
9. 如权利要求7所述的蛋白质类泛素化修饰的检测质粒的制备方法，其特征在于，所 述待测蛋白质为 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、Androgen receptor、Mdm2、 Topo I 、Topo II、WRN、glut4、TDG、Cul-l、Cul-2、Cul-3、Cul-4A、PLCYl、JAKl、STAT-l、ERKl、 Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、CLK4 或 Snu66。
10. -种蛋白质类泛素化修饰的检测试剂盒，其特征在于，包括检测质粒、待测蛋白质 表达质粒、蛋白质纯化试剂、双砷荧光染料标记试剂和多聚链聚合度量化分析内参试剂， 其中，所述检测质粒含有相连的类泛素化修饰蛋白的编码基因和四半胱氨酸多肽标签 的编码基因，所述四半胱氨酸多肽标签的编码基因位于所述类泛素化修饰蛋白的编码基 因的5'端，所述四半胱氨酸多肽标签的编码基因为ISbp~36bp ; 所述四半胱氨酸多肽标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半胱氨酸，所述X 为除半胱氨酸以外的任一氨基酸。
【专利摘要】本发明提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测方法，该方法将表达待测蛋白质的重组质粒以及表达带四半胱氨酸多肽标签的类泛素化修饰蛋白的重组质粒共转染宿主细胞进行蛋白质的类泛素化修饰，然后进行蛋白质纯化、双砷染料标记、并对待测蛋白质的类泛素化修饰进行检测和待测蛋白质的多聚类泛素化修饰的修饰程度进行量化分析；该方法灵敏度高，简单易行。此外，本发明还提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测质粒及其制备方法；另外，本发明还提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测试剂盒。
【IPC分类】C12N15-85, C12N15-66, G01N21-64, C12N15-63, G01N1-28
【公开号】CN104749143
【申请号】CN201310752040
【发明人】张春阳, 杨用
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月31日