[0042] 2、胶体金的制备：
[0043] 采用柠檬酸三钠法制备胶体金。先取200mL去离子水倒入用于制备胶体金的三角 瓶中，于恒温电磁搅拌器上加热至沸腾一分钟进一步清洗之后，小心倒掉沸水。取浓度为 0. 01 %HAuCl4水溶液（已过0. 22ym水系膜）IOOmL倒入三角瓶，加热到沸腾。沸腾后，快 速小心加入2. 25mL1%的柠檬酸三钠水溶液（已过0. 22ym水系膜），2分钟内可观察到明 显的颜色变化。当胶体金溶液呈现稳定的颜色不再变化时继续煮沸15分钟。室温冷却后 用去离子水定容至100mL，转移至清洗过的玻璃瓶中4°C保存备用。制备好的胶体金溶液清 亮透明，呈酒红色，表面无漂浮物。
[0044] 3、青霉噻唑酸抗体一胶体金标记物的制备：
[0045] 磁力搅拌下，按每mL胶体金加入10yL0. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值，然后 按每mL胶体金加入36yg青霉噻唑酸抗体，轻微振摇使其混匀，4°C静置60分钟。然后按 每mL胶体金中加入20yL20%的BSA以封闭胶体金表面多余的残基。室温静置30分钟 后，再向其中加入IOuL20%的PEG20000(聚乙二醇20000)后室温静置30分钟。4°C条 件下2000rpm低速离心15分钟弃沉淀取上清。将上清于4°C条件下1000 Orpm高速离心30 分钟。弃去上清液，向得到的沉淀中加入200yL胶体金标记抗体稀释液稀释5倍，4°C保存 备用。
[0046] 4结合垫的制备
[0047] 将结合垫2浸泡于0.01MpH7.4磷酸缓冲液（配方及制备：2gBSA，500yL TritonX-100, 5g蔗糖，0?Ig聚乙烯基吡咯烷酮，0? 02g叠氮钠，0? 02g磷酸二氢钠，0? 29g磷 酸氢二钠，用超纯水定容至IOOmL)中5min后，烘干。然后30yL/cm青霉噻唑酸抗体一胶 体金标记物包被于结合垫上，真空干燥。
[0048] 5硝酸纤维素膜的包被
[0049] 用上海金标的双维平面划膜仪将制备的青霉噻唑酸抗原（含3%甲醇）包被于硝 酸纤维素膜3上作为检测线5,包被量为0. 9yL/cm;将购买的羊抗兔二抗（浓度mg/ml)包 被于硝酸纤维素膜3上作为质控线6,包被量为0. 9yL/cm，37°C烘干，封装备用。
[0050] 6试纸条的组装
[0051] 将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4按图1所示的顺序依次粘附在PVC 板8g上，切成3. 7mm宽的小条，真空封装。常温保存，有效期2个月。
[0052] 实施例3(应用实施例）
[0053] 青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条使用方法
[0054]1、牛奶样品的预处理
[0055] 取牛奶样品经1000 Orpm离心30min后，取中间层加入0. 5%聚乙烯比咯烷酮做掩 蔽剂进行测定。
[0056] 取奶粉配成复原乳，经1000 Orpm离心30min后，取中间层加入0. 5%聚乙烯比咯烷 酮做掩蔽剂进行测定。
[0057] 2、检测步骤
[0058] 用吸管吸取100 y 1待检牛奶缓慢滴加在胶体金试纸条的加样孔上，10分钟后观 察结果。
[0059] 3、结果判定
[0060] 如图2所示，若待测样品试纸条检测线颜色与质控线颜色基本一致，则判断为阴 性样品，即不含青霉噻唑酸；若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于质控线颜色或检测线 颜色消失，则判断为阳性样品，即待测样品中含有青霉噻唑酸，说明是人为的添加了e-内 酰胺酶的牛奶，阳性结果和阴性结果，质控线均显红色条带，若质控线红色条带消失，则试 纸条检测失效。
[0061] 实施例4 (应用实施例）
[0062] 本发明的应用效果举例
[0063] 本实施例中所指的青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条检测方法参照实施例3所 述的操作步骤，其检测结果如下。
[0064] 1、特异性试验
[0065] 如图3所示，按实施例3所述方法进行试验，检测青霉素、氯霉素、三聚氰胺、四环 素、沙丁胺醇、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪（均购自美国sigma公司），除 了与青霉噻唑酸结构十分相似的青霉素在浓度为1000Ug/L时检测线颜色略浅于质控线， 有一定的交叉反应，其余8种药品检测线均与质控线颜色基本一致，说明本发明的试纸条 与其他常检的药品无交叉反应，显示本发明青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条具有好的特 异性。
[0066] 2、灵敏度试验
[0067] 如图4所示，按实施例3所述方法进行试验。当青霉噻唑酸标准品浓度低于10yg/ L时，试纸条检测线显色结果与质控线颜色目测比较无差别；当青霉噻唑酸标准品浓度为 10Ug/L时，试纸条检测线显色结果与质控线颜色目测比较有明显区别；当青霉噻唑酸标 准品浓度继续增大，检测线逐渐变浅；青霉噻唑酸标准品浓度为50yg/L时，检测线基本消 失。因此确定方法的目视检测限为10yg/L。
[0068] 3、稳定性试验
[0069] 如图5所示，将本发明研制的试纸条置于室温条件下，按实施例3所述方法进行实 验，分别定期检查试纸条的有效性。观察颜色条带结果显示，试纸条室温下保存时，八周内 平均温度在20°C左右。由图可见，八周后检测时，检测线颜色明显，灵敏度仍然很好，检测结 果准确可靠。因此，试纸条可于室温下至少保存2个月，检测结果仍然准确可靠。
[0070] 4、加标样品的检测
[0071] 如图6所示，向牛奶阴性样品中添加青霉噻唑酸标准品，样品中最终浓度为 10yg/L、50yg/L、100yg/L，1000 Orpm离心30min后，取中间层加入0? 5%聚乙烯比咯烷酮 做掩蔽剂，进行检测。按实施例3所述方法进行实验，检测结果如图6。
[0072] 如图7所示，将奶粉配成复原乳，分别添加青霉噻唑酸标准品使样品最终浓度为 40yg/kg、100yg/kg、200yg/kg。离心后，加入0. 5%聚乙稀比略烧酮做掩蔽剂，进行检测。 按实施例3所述方法进行实验，检测结果如图7。
[0073] 按实施例3所述方法进行实验。并与酶联免疫吸附法（ELISA)检测结果进行比较。
[0074] 表1各种样品不同添加水平的ELISA与GICA测定结果的比较
[0075]
【主权项】
1. 一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸 水垫d和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维 素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有青霉噻唑酸抗体一胶体金标记物；所述的硝酸纤维 素膜上分别包被有青霉噻唑酸抗原构成的检测线e和羊抗兔二抗构成的质控线f，两条线 间隔距离为5mm。
2. 权利要求1所述的一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在 于，包括如下步骤： (1) 青霉噻唑酸抗血清纯化，得到青霉噻唑酸多克隆抗体； (2) 制备青霉噻唑酸抗原； (3) 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金； (4) 将步骤（1)纯化的抗体加入到步骤（3)制备的胶体金中，制备青霉噻唑酸抗体一胶 体金标记物； (5) 将步骤（4)制备的青霉噻挫酸抗体一胶体金标记物包被于结合垫上； (6) 将步骤（2)制备的青霉噻唑酸抗原包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，并将羊抗 兔二抗包被于硝酸纤维素膜上构成质控线； (7) 在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的 青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条。
【专利摘要】本发明提供了一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条，包括样品垫a、结合垫b、硝酸纤维素膜c、吸水垫d和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫a、结合垫b、硝酸纤维素膜c、吸水垫d；所述的结合垫b上包被有青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜c上分别包被有青霉噻唑酸抗原构成的检测线e和羊抗兔二抗构成的质控线f。本发明还公开了这种试纸条的制备方法。发明具有以下突出的优点：1、特异性高，灵敏度好；2、检测成本低。3、操作简便；4、储存方便，在室温下可保存2个月。
【IPC分类】G01N33-558
【公开号】CN104764878
【申请号】CN201510100228
【发明人】张燕, 刘冰, 生威, 王硕
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月6日