噬细胞RAW264. 7在不加任何药物、分别加入第二指定浓度目标中药各 分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物、及分别加 入第二指定浓度目标中药各分离组分的小鼠巨噬细胞RAW264. 7的数量n#S2;并以不加任 何药物的小鼠巨噬细胞RAW264. 7的数量2为标准，分别计算加入第二指定浓度目标中 药各分离组分后的小鼠巨噬细胞RAW264. 7存活率K#S2;如果存活率K #冑2在85%以上，则 确定所述第二指定浓度为为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
[0083] 其中，目标中药各分离组分的心肌细胞存活率K#S2的计算公式可以为：
[0084] K分离2 % = (η分离2/n对照2) X 100% 〇
[0085] 在用阳性药进行实验时，通过实验确定一系列不同浓度的阳性药的RAW264. 7细 胞的数量nwft2，并通过公式
[0086] K阳性 2 % - (η阳性 2/i!对照 2) X 100 %
[0087] 来确定阳性药RAW264. 7细胞存活率Kp日性2。
[0088] 在一些实施方式中，（b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确 定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培 养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细 胞的NO相对抑制率，具体可以为：
[0089] 将相同数量的小鼠巨噬细胞RAW264. 7分成对照2组、实验2组及模型2组在相同 的条件下进行培养；其中，实验2组加入在（a)部分已确定浓度的目标中药各分离组分及脂 多糖；对照2组不加入任何物质，模型2组只加入脂多糖；培养结束后，取对照2组、实验2 组及模型2组培养液中的上层清液；采用Griess法，通过酶标仪在第二预设波长下分别测 定对照2组吸光度值DO 5iffi2、实验2组吸光度值DOs^2及模型2组吸光度值DO eS2;通过 计算分别得到实验2组的相对NO抑制率，
[0090] 其中，实验2组的相对NO抑制率的计算公式为：
[0091 ] D实验 2 % = (DO模型 2 -DO实验 2)/ (DO模型 2 -DO对照 2) X 100 % 〇
[0092] 如前所述，在用阳性药进行实验时，可以增设阳性药2组，并与目标中药各分离组 分进行相同的实验，最后得到阳性药2组吸光度值DO wt42，并通过公式
[0093] D阳性 2 % = (D0阳性 2_D0模型 2) / (D0对照 2_D0模型 2) X 100 %
[0094] 阳性药2组的相对NO抑制率Dp日性2。
[0095] 下面将以通脉氧心丸为例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。
[0096] 首先，对实施例中所需的仪器与试剂进行说明。
[0097] 仪器：二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo);超净工作台（美国Thermo) ;Anke LXJ-IIB低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；CKX41倒置相差荧光显微镜 (日本OLYMPUS);细胞自动计数仪（美国invitrogen) ;Eppendorf恒温混勾器（Thermo mixer comfort) ;Infinite 200 多功能酶标仪（瑞士 TECAN) ;Bio_Tek 酶标仪（ELX800); Agilent 1100型制备液相色谱仪（Agilent公司）；Finnigan LCQ Deca XPplus离子肼质谱 仪（Thermo Finnigan 公司，美国）；Triple TOFTM 5600+高分辨质谱仪（AB Scienx 公司， 美国）；Milli-Q超纯水系统（Millipore公司，美国）。
[0098] 试剂：高糖DMEM基础培养基、胎牛血清（FBS)、胰酶-EDTA、抗生素（青霉素/链霉 素）均购自Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO)、溴化-3-(4, 5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二 苯基四氮唑（MTT)、LPS(细菌脂多糖）均购自Sigma公司；槲皮素、甘草酸、戈米辛D、五味 子醇甲、芒柄花素、甘草苷、芹糖异甘草苷、异麦角留苷购自上海融禾医药科技有限公司；双 氧水购自阿法埃莎（天津）化学有限公司；一氧化氮检测试剂盒（碧云天）；甲酸为色谱纯 (Roe Scientific Inc.);乙腈为色谱纯（Merck 公司）。
[0099] 通脉养心丸，天津中新药业乐仁堂制药厂生产，批号：A107626
[0100] 实施例一确定通脉养心丸中具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分
[0101] (1)化学组分的初步分离
[0102] 将目标中药，即通脉养心丸的丸剂置于研钵中研碎，10倍量甲醇超声提取50分钟 后倾出提取液，同法超声提取两次。对两次提取液进行抽滤，将滤液通过以十八烷基硅烷键 合硅胶为填料的中压反相色谱柱（0DS中压柱）。先以纯水洗涤，洗涤液弃去；再用甲醇进 行洗脱，将洗脱液通过制备液相色谱进行分离，收集目标中药各分离组分；色谱柱型号：SN USA GH01324,流动相为0. 1 %甲酸-水（A)、乙腈（B)，流速为IOmL/分钟，柱温为室温，检测 波长为 210nm、230nm、250nm、254nm、280nm。洗脱梯度如下：0 分钟 A:B = 95:5 ;60 分钟 A:B =10:90 ;72分钟A:B = 5:95 ;82分钟A:B = 5:95。除去量太少的几个组分之外，共获得 18个分离组分，根据流出先后顺序依次编号为TM01-TM18。
[0103] 需要说明的是，在本步骤中，所描述的具体实验参数，例如甲醇的体积分数，甲醇 的用量、制备液相色谱条件等，都是适用于通脉养心丸的，当采用本发明的技术方案来实现 其它目标中药的化学组分的初步分离时，具体的实验参数可以由本领域技术人员来进行确 定，例如可以采用积分数为0~100%的甲醇水溶液，中压为5~20bar。制备液相色谱条 件可以为：流速为8~12mL/分钟，柱温为20~30°C，A相为0. 01~1%甲酸-水等。 [0104] (2)确定具有心肌保护作用的活性成分
[0105] A首先要确定通脉养心丸的18个分离组分对H9c2心肌细胞的细胞毒评价
[0106] 具体为：以槲皮素（Quercetin，在附图中简称为Q)为阳性药1，分别考察其浓度为 60 μ mol/L、40 μ mol/L和20 μ mol/L的细胞毒，以及通脉养心丸各分离组分浓度为50 μ g/ ml的细胞毒。
[0107] 分别将相同数量的H9c2心肌细胞在不加任何药物、加入指定阳性药1或加入所得 到的18个分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物 的H9c2心肌细胞的数量η顺丨、加入指定阳性药1的H9c2心肌细胞的数量Ii pmi、加入18 个分离组分的H9c2心肌细胞的数量n#s i;并以不加任何药物的H9c2心肌细胞的数量为标 准，分别计算加入指定阳性药1、目标中药各分离组分后H9c2心肌细胞存活率；以不加任何 药物的对照组（CON)心肌细胞的数量为标准分别计算加入指定阳性药1后H9c2心肌细胞 存活率K p日t4l、分别加入18个分离组分后H9c2心肌细胞存活率K#s i;以存活率85%以上 认定无显著细胞毒。
[0108] 其中，K阳性i % = (η阳性i /n对照i) X 100 % ;
[0109] K分离丄％ = (η分离丄/n对照丄)X 100 % ;
[0110] 结果见图1，表明除了 TM15有一定细胞毒外，其余组分在50 μ g/ml浓度下无显 著细胞毒性。因此在后续实验中除了分离组分TM15降为20 μ g/ml外，其他分离组分仍为 50 μ g/ml〇
[0111] B筛选通脉养心丸的18个分离组分中具有心肌细胞保护作用的分离组分
[0112] 细胞：H9c2心肌细胞
[0113] 实验仪器、试剂：噻唑蓝（MTT)，DMEM高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO、C02培养 箱，倒置显微镜，超净工作台，平板振荡仪
[0114] H9c2心肌细胞计数，分成对照1组、实验1组、阳性药1组及模型1组培养于96孔 板平底培养板。培养24小时后，实验1组以通脉养心丸的18个分离组分预保护，阳性药1 组以槲皮素预保护，对照1组及模型1组不加任何药物，再将4个组置于CO 2细胞培养箱中 培养24小时。除对照组外，实验1组、阳性药1组及模型1组分别加620 μ mol/L双氧水损 伤，每孔100 μ L，损伤3小时。损伤完毕后对照组，实验1组、阳性药1组及模型1组每孔加 0. 5mg/ml的ΜΤΤ100 μ L。孵育4小时后，弃去MTT溶液，每孔加100 μ L DMS0,于恒温混匀 器内混匀10分钟，采用MTT法测定细胞存活率，即酶标仪在550nm下测定对照1组吸光度 值DO 5iffi i、实验1组吸光度值DOisu、阳性药1组吸光度值DOwt4 i及模型1组吸光度值DO tssi。每个样品设3复孔，重复3次实验，趋势一致情况下计算阳性药1和18个分离组分对 H9c2心肌细胞的相对保护率，相对保护率可以表示H9c2心肌细胞的抗氧化损伤活性。
[0115] 其中，实验1组的相对保护率S实验的计算公式为：
[0116] S实验丄％ = (D0实验丄_D0模型丄）/ (D0对照丄_D0模型丄）X 100 % ;
[0117] 阳性药1组的相对保护率Swt4l的计算公式为：
[0118] S阳性丄％ = (D0阳性丄_D0模型丄）/ (D0对照丄_D0模型丄）X 100 % ;
[0119] 根据阳性药活性和以往研宄经验，可以设定最低有效率为50%的相对保护率。当 然，本领域技术人员也可以根据实际情况设