定其它值作为最低有效率。结果见图2,表明在 50 μ g/ml浓度下，TM13(保护率为65. 04% )、TM14(保护率为54. 48% )、TM16(保护率为 74. 99 % )、TM17 (保护率为 107. 07 % )，TM15 在浓度为 20 μ g/mL (保护率为 68. 78 % )，与 模型组细胞存活率均有显著性差异（P〈〇. 05)，有一定的心肌细胞保护活性。尤其是TM17的 分离组分，其保护率超过100%，显示其在抗氧化过程中不仅具有较强的抗氧化活性，还具 有一定的促进细胞增殖的活性。
[0120] 通脉养心丸中具有心肌细胞保护作用的分离组分的量效关系研宄
[0121] 对通脉养心丸组分中相对细胞保护率在50%以上的分离组分（TM13、TM14、TM15、 TM16、TM17)进行心肌细胞保护活性量效关系研宄，方法与步骤（2)B部分中的实验方案相 同，每个样品设3复孔，重复3次实验，趋势一致情况下研宄各分离组分对H9c2心肌细胞 保护活性量效关系。实验结果见图3,结果表明，TM13、TM14、TM16、TM17在50 ymol/L~ 1. 5 μ mol/L，TM15 在 20 μ mol/L ~0. 625 μ mol/L 呈现较好的量效关系。
[0122] (：将实验1组中相对保护率达到50%的分离组分〇￥13、了]?14、了]\115、了]\116、了]\117) 经LC-MS分析，确定出相对保护率达到50%的各分离组分中所包含的化学成分；结果分别 如图4所示，其中，图4a为TM13的LC-MS图，图4b为TM14的LC-MS图，图4c为TM15的 LC-MS图，图4d为TM16的LC-MS图，图4e为TM17的LC-MS图；从各图中可以看出，TM13中 的主要成分为甘草酸、五味子醇甲、甘草香豆素，戈米辛D、甘草异黄酮，等；TM14中的主要 成分为甘草酸、甘草香豆素、乌拉尔甘草皂苷B、大黄素、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q， 等；TM15中的主要成分为甘草酸、甘草香豆素、新甘草酚、当归酰戈米辛Q等；TM16中的主 要成分为甘草酸、甘草香豆素、当归酰戈米辛P、Glyasperin A (粗毛甘草素A)等；TM17中 的主要成分为甘草酸、甘草香豆素、甘草利酮、甘草宁L，等。
[0123] 将上面所确定的化学成分分别代替步骤（2)中B部分的脉养心丸的18个分离 组分，重复执行步骤（2)中的B部分，确定各化学组分的相对保护率，并将相对保护率达 到50%的化学成分确定为具有心肌保护作用的活性成分，经验证实验发现的各活性成分在 50 μ M浓度下的心肌细胞保护率如表1所示。
[0124] 表1具有心肌细胞保护活性的化合物及其保护率
[0125]
【主权项】
1. 确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分； (2) 通过心肌细胞抗氧化模型实验确定具有心肌保护作用的活性成分，所述心肌细胞 抗氧化模型实验包括： (A) 将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞 毒的目标中药各分离组分的浓度； (B) 将目标心肌细胞分别用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分进行保 护，然后用指定氧化剂分别对已进行保护的目标心肌细胞进行损伤，并确定损伤后的目标 心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相 对保护率； (C) 将对目标心肌细胞相对保护率达到最低有效率的目标中药分离组分经LC-MS分 析，确定出相对保护率达到最低有效率的各分离组分中所包含的化学成分； 用所确定的化学成分分别代替（B)部分的目标中药各分离组分，重复执行的（B)部分 的操作，确定各化学成分的相对保护率，并将相对保护率达到最低有效率的化学成分确定 为具有心肌保护作用的活性成分； (3) 通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分，其中所述巨噬细胞抗 炎模型实验包括： (a) 将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞 毒的目标中药各分离组分的浓度； (b) 将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度 的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含 量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率； (c) 将对目标巨噬细胞的NO相对抑制率达到抗炎有效率的目标中药分离组分经LC-MS 分析，确定出NO相对抑制率达到抗炎有效率的各分离组分中所包含的化学成分； 用所确定的化学成分分别代替（b)部分的目标中药各分离组分，重复执行（b)部分的 操作，将NO相对抑制率的半数抑制浓度在指定值以下的化学成分确定为具抗炎作用的活 性成分。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)包括：获得目标中药的中药提取 液，然后使所述中药提取液通过反相色谱柱；再对反相色谱柱进行洗脱，将洗脱液通过制备 液相色谱进行分离，收集目标中药各分离组分。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述获得目标中药的中药提取液，包括： 将目标中药与甲醇水溶液混合后，进行提取、过滤，得到中药提取液； 所述反相色谱柱具体为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的中压反相色谱柱。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（A)将目标中药各分离组分针对目标心 肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为： 将H9c2心肌细胞在不加任何药物、分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组分的 情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物及分别加入第一指定浓 度的目标中药各分离组分的J19c2心肌细胞的数量；并以不加任何药物的H9c2心肌细胞的 数量为标准，分别计算加入第一指定浓度的目标中药各分离组分后!19C2心肌细胞存活率； 如果存活率在85%以上，则确定所述第一指定浓度为无显著细胞毒的该目标中药分离组分 的浓度。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（B)将目标心肌细胞用已确定无显著细 胞毒的浓度的目标中药各分离组分分别对目标心肌细胞进行保护，然后用指定氧化剂其进 行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各 分离组分对目标心肌细胞的相对保护率，具体为： 将H9c2心肌细胞分成对照1组、实验1组及模型1组在相同的条件下进行培养；其中， 实验1组加入在（A)部分已确定浓度的目标中药各分离组分进行预保护；对照1组及模型 1组不加任何药物；培养结束后，将实验1组及模型1组分别加入指定氧化剂进行H9c2心 肌细胞损伤；损伤后，通过酶标仪在第一预设波长下分别测定对照1组吸光度值DO5iffil、实 验1组吸光度值DOisu及模型1组吸光度值DOSS1 ;通过计算分别得到实验1组的相对保 护率S实验：， 其中，实验1组的相对保护率的计算公式为： S实验1 % =?〇实验I~DO模型工）/(D0对照工_D0模型工）X 100 %。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（a)将目标中药各分离组分针对目标巨 噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为： 将小鼠巨噬细胞RAW264. 7在不加任何药物、分别加入第二指定浓度目标中药各分离 组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物、及分别加入第 二指定浓度目标中药各分离组分的小鼠巨噬细胞RAW264. 7的数量；并以不加任何药物的 小鼠巨噬细胞RAW264. 7的数量为标准，分别计算加入第二指定浓度目标中药各分离组分 后的小鼠巨噬细胞RAW264. 7存活率；如果存活率在85 %以上，则确定所述第二指定浓度为 为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的 培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂， 培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分 离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率，具体为： 将相同数量的小鼠巨噬细胞RAW264. 7分成对照2组、实验2组及模型2组在相同的条 件下进行培养；其中，实验2组加入在（a)部分已确定浓度的目标中药各分离组分及脂多 糖；对照2组不加入任何物质，模型2组只加入脂多糖；培养结束后，取对照2组、实验2组 及模型2组培养液中的上层清液；采用Griess法，通过酶标仪在第二预设波长下分别测定 对照2组吸光度值DO5iffi2、实验2组吸光度值DOs^2及模型2组吸光度值DO2;通过计 算分别得到实验2组的相对NO抑制率， 其中，实验2组的相对NO抑制率的计算公式为： D实验2%=(D0模型2~〇0实验2)/ (D0模型2 -DO对照2) X 100 %〇
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标中药为通脉养心丸。
【专利摘要】本发明实施例公开了一种在治疗缺血性心脏病的中药中具有心肌保护作用和抗炎作用的活性成分的确定方法，包括以下步骤：(1)通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分；(2)通过心肌细胞抗氧化模型实验确定具有心肌保护作用的活性成分；(3)通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分。根据所确定出的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分，可以容易地确定中药活性成分的含量，进而可以实现对目标中药的质量控制，保证对目标中药的临床疗效。
【IPC分类】G01N30-02, G01N33-50, A61P29-00, A61K36-00, A61P9-00
【公开号】CN104777247
【申请号】CN201510153084
【发明人】王怡, 王磊, 高秀梅, 金兆祥, 李来来, 杨瑾, 张伯礼, 胡利民
【申请人】天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂, 天津中医药大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月2日