测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及测定牛乳中K -酪蛋白含量的方法。更 具体地，本发明涉及用于对毛细管进行涂层处理的试剂及测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方 法。
【背景技术】
[0002] κ-酪蛋白是酪蛋白组分中含量最少的一种蛋白质，约占总酪蛋白的12%，占牛 乳中总蛋白质的10%。κ-酪蛋白的相对分子质量约为19000D，含有169个氨基酸残基，1 个磷酸基团。
[0003] 然而，目前测定牛乳中κ -酪蛋白含量的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提供一种用于对毛细管进行涂层处理的试剂以及一种检测κ-酪蛋白含量的方法。该 测定κ-酪蛋白含量的方法以及利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛细管 测定κ -酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准 确性强。
[0005] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] 国际标准DIN-10470-2011提出了一种《牛奶和牛奶制品的全部蛋白质中乳蛋白 含量和酪蛋白含量测定》的测定方法。但该方法只是对乳中总的酪蛋白含量进行了定量检 测，而未对具体的κ-酪蛋白含量进行分析。κ-酪蛋白由于含量低，检测难度大。
[0007] 本发明的发明人经过大量实验发现，预先将未涂层毛细管进行涂层处理，然后采 用毛细管电泳法检测经过预处理的牛乳，基于检测结果确定牛乳中κ-酪蛋白的含量。由 此，该测定κ-酪蛋白含量的方法以及利用该用于对毛细管进行涂层处理的试剂得到的毛 细管测定κ -酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以 及准确性强。
[0008] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于对毛细管进行涂层处理的试剂。根 据本发明的实施例，所述毛细管用于通过毛细管电泳法测定牛乳中κ-酪蛋白含量，所述 试剂是含有下列的水溶液 ：200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；120mmol/L的十六烷基溴化 铵；80mmol/L的聚乙二醇；和60mmol/L的戊二胺，其中，所述试剂的pH值为8. 5。发明人发 现，利用该试剂对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提 高测定牛乳中κ-酪蛋白含量的准确性。由此，根据本发明实施例的利用该用于对毛细管 进行涂层处理的试剂得到的毛细管测定κ-酪蛋白含量具有下列优点的至少之一：分离效 果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
[0009] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法。根 据本发明的实施例，该方法包括：（1)采用毛细管电泳法对所述牛乳进行检测，其中，所述 毛细管电泳法采用预先利用前面描述的试剂进行涂层处理的毛细管；（2)基于步骤（I) 中所得到的毛细管电泳结果，确定所述牛乳中的K-酪蛋白含量。如前所述，利用该试剂 对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高测定牛乳中 K-酪蛋白含量的准确性。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中K-酪蛋白含量的方法具 有下列优点的至少之一：分离效果好、检测时间短、重复性高以及准确性强。
[0010] 根据本发明的实施例，上述测定牛乳中K-酪蛋白含量的方法还可以具有下列附 加技术特征至少之一：
[0011] 根据本发明的实施例，所述涂层处理包括：（1)涂层处理试剂的配制：用去离子水 准确配制100mL涂层处理试剂，其中各成分及其浓度包括：三羟甲基氨基甲烷200mmol/L， 戊二胺60mmol/L，十六烷基漠化钱120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0. lmol/L NaOH调节 pH值至8. 5 ; (2)缓冲溶液的配制：用去离子水准确配制100mL缓冲溶液，其中各成分及其 浓度包括：硼酸50mmol/L，尿素6mol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，轻丙 基甲基纤维素0. 05质量体积％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.1mol/LNaOH调节pH至 8. 5 ; (3)涂层的形成：用浓度为0. 1~0. 5mol/L的NaOH冲洗毛细管内壁3~5分钟，并用 去离子水冲洗3~5分钟，接着用涂层处理试剂冲洗3-10分钟，静置5-10分钟，再用缓冲 溶液冲洗3-5分钟，将上述涂层的形成步骤循环2-5次。由此，根据本发明实施例的测定牛 乳中κ -酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重 复性或者较强的准确性。
[0012] 根据本发明的实施例，所述毛细管预先经过活化处理，所述活化处理包括：（1)将 毛细管用色谱级甲醇冲洗5~20分钟，并用去离子水冲洗5~20分钟；（2)将经过步骤（1) 处理得到的毛细管用1~4mol/L NaOH冲洗5~20分钟，静置5~30分钟；以及（3)将经 过步骤（2)处理得到的毛细管用去离子水冲洗5~20分钟。由此，根据本发明实施例的测 定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高 的重复性或者较强的准确性。
[0013] 根据本发明的实施例，所述牛乳包括选自生牛乳、超高温灭菌牛乳以及巴氏灭菌 牛乳的至少一种。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一 步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
[0014] 根据本发明的实施例，所述采用毛细管电泳法进行检测前，预先将所述牛乳进行 预处理，所述预处理包括：（1)将所述牛乳用乙酸调节PH值，离心并弃上清，并用水洗涤沉 淀3~5次，离心，收集沉淀；（2)将步骤⑴所得到的沉淀用硼酸调节pH值；以及⑶取 步骤⑵所得到的混合物10mL，添加尿素以及二硫苏糖醇，振荡混勾，并静置处理，以便得 到待测液。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有 较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
[0015] 根据本发明的实施例，在步骤（1)中，用浓度为30~80mmol/L的所述乙酸调节pH 值至4. 6 ;在步骤（2)中，用浓度为20~70mmol/L的所述硼酸调节pH值至6. 6 ;所述尿素 浓度为6mol/L，添加量为3. 6克，所述二硫苏糖醇的添加量为0. 05克，所述静置时间为10 分钟。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好 的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
[0016] 根据本发明的实施例，针对所述生牛乳，所述预处理进一步包括：将所述生牛乳 用乙酸调节pH值之前，预先将所述生牛乳离心，并进行冷冻处理，任选地，所述离心是在 3000~10000r/min的转速下进行10~30分钟；所述冷冻处理是在-40摄氏度的温度下 进行10~30分钟。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中K-酪蛋白含量的方法可以进 一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或者较强的准确性。
[0017] 根据本发明的实施例，将所述待测液进行所述毛细管电泳法检测前，预先将所述 待测液中κ -酪蛋白的浓度调节至〇. 25~4mg/ml。由此，根据本发明实施例的测定牛乳中 κ -酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复性或 者较强的准确性。
[0018] 根据本发明的实施例，所述毛细管电泳法测定是按照下列条件进行的：毛细管的 内径为25-75 μπκ总长度为200-900mm、有效长度为100-800mm ;检测波长为200-450nm ;检 测温度为15_40°C ;进样方式为压力进样或真空进样；压力为O-Ipsi ;进样时间为ls-20s ; 工作电压为7-30kv ;以及检测频率为5-18Hz，优选地，所述检测温度25°C;所述毛细管的内 径为25-75 μπκ所述总长度为600mm ;所述进样方式为压力进样；所述压力为0· 5psi ;所述 进样时间为l〇s-20s ;以及所述工作电压为20-30kv。由此，根据本发明实施例的测定牛乳 中κ -酪蛋白含量的方法可以进一步具有较好的分离效果、较短的检测时间、较高的重复 性或者较强的准确性。
[0019] 此外，根据本发明的实施例，本发明提供的用于对毛细管进行涂层处理的试剂及 测定牛乳中K-酪蛋白含量的方法具有以下优点的至少之一：
[0020] 1、根据本发明的实施例，将用于对毛细管进行涂层处理的试剂对毛细管进行涂层 处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高测定牛乳中K-酪蛋白含量的 准确性。
[0021] 2、根据本发明的实施例，样品离心时间短，脂肪去除率高，且样品经冷冻处理后， 可以使部分酪蛋白胶束实现分离。
[0022] 3、根据本发明的实施例，κ -酪蛋白含量出峰时间约为10. 5分钟左右，分离速度 较快，能够实现快速分离的目的。
[0023] 4、根据本发明的实施例，本发明能够测定含量为0. 25mg/ml-4mg/ml的κ -酪蛋 白，能够有效地检测出较低含量的κ-酪蛋白。
[0024] 本发明的附加