专利名称：牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法
技术领域：
本发明利用碱性蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抗氧化肽，属于生物技术领域。
背景技术：
人体自由基的来源有两种，一是生物 在氧化反应或其伴随的次反应中产生，二是空气污染、食物中的脂肪腐败、吸烟和紫外线作用与生物体产生。生物有自身的清除自由基防御系统。但自身的防御系统不足以清除自由基时，自由基会造成DNA损伤、细胞膜磷脂过氧化和低密度脂蛋白的改变，启动慢性疾病的发生。目前认为有70多种病与自由基有关，包括心脏病、动脉硬化、静脉炎、关节炎、过敏、白内障、老年痴呆、冠心病及癌症。人们需要抗氧化剂去抵抗氧化应激反应，合成的抗氧化剂虽然高效、廉价，但由于有副作用，人们更青睐于选择天然的抗氧化剂。食物来源的抗氧化剂很多，人们从植物和动物源的蛋白中都获得了抗氧化肽。其中包括花生、米糠、玉米、苜蓿、山药、豆奶、鱼类、蛋黄蛋白、酪蛋白等。牦牛乳酪蛋白是以西北特有的资源曲拉为原料，通过提取纯化制备的蛋白质，是无限量添加的食品添加剂和营养强化剂。由于酪蛋白疏水性氨基酸含量高，蛋白质含量在90%以上，牦牛乳酪蛋白不易溶于水，溶于弱碱液。活性肽是包含在完成蛋白质结构中的特定序列，只有通过水解后，才能释放出各种生理功能，这些肽主要含2 20个氨基酸残基，分子量小于6000Da。表现出阿片肽、矿物质吸收、免疫调节、抗微生物、抗血栓、降血脂、抗氧化、降血压等特性。抗氧化肽的活性主要和肽的结构、组成和疏水性有关。其中酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、胱氨酸和组氨酸的存在对抗氧化肽的活性影响最大。除此外氨基酸在肽中的位置、蛋白的种类、水解酶的种类、肽的分子量和肽的含量都对抗氧化活性有影响。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法。用碱性蛋白酶水解酪蛋白制备抗氧化肽，实现了牦牛乳酪蛋白的深加工，缓解食物源抗氧化肽市场供应不足的问题，工艺简单，抗氧化活性高，适合工业化推广生产。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤(I)牦牛乳酪蛋白溶解称取牦牛乳酪蛋白20g 40g，加水500mL，调节反应温度30°C 60°C，pH7. O 9. 0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司(2)加碱性蛋白酶水解吸取250μ L 500 μ L酶液，维持反应温度30°C 60°C，pH7. O 9. 0，反应I 4小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2. 4L FG ；(3)灭活碱性蛋白酶，升温至80°C 100°C，维持15 30分钟；(4)沉淀酪蛋白用5mol/L盐酸调节pH到4. I 4. 6,使酪蛋白在其等电点处析出；(5)离心4000g IOOOOg离心力，离心5 30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上
清液；(6)超滤取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；(7)喷雾干燥取步骤(6)中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。还包括有在步骤(6)超滤后还包括有纳滤步骤取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；然后进行喷雾干燥步骤取纳滤回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。所选用的酶制剂为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种。对以上方法得到的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽进行抗氧化活性测定DPPH(1，I 二苯基 2 苦基苯肼)自由基清除测定方法其操作步骤如下①分别吸取ImL待测液(10mg/mL)和ImL DPPH的无水乙醇溶液(I X 10 4mol/L)置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ai ；②分别吸取ImL待测液(lOmg/mL)和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Aj ；③分别吸取DPPH和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ac。结果计算
DPPH 清除率(％) =1- ............................X 100
Ac羟自由基清除测定方法其操作步骤如下①试剂配制7. 5mmol/L邻二氮菲的配制称取0. 1487g邻二氮菲溶于IOOml蒸馏水中。PH7. 4，0. 75mol/L磷酸缓冲液的配制称取磷酸氢二钠106. 5g,溶于IOOOmL蒸馏水中，用酸度计调两者于PH7. 4。0. 1%过氧化氢的配制取0. Iml过氧化氢加入99. 9ml蒸馏水中。7. 5mmol/L硫酸亚铁的配制取0. 114g硫酸亚铁溶于IOOml蒸懼水中。②测定方法取3个反应试管，分别标号AP、Ab和As，按照表1，分别加入反应溶液，每加一管后迅速摇匀，在37°C温浴I小时。待反应完全后在波长536nm处测定吸光度。羟自由基(HO ·)清除率⑷按下式计算d(% ) = [A-Ap / Ab Ap] X 100。表I反应体系表
权利要求
1.一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (O牦牛乳酪蛋白溶解称取牦牛乳酪蛋白20g 40g，加水500mL，调节反应温度30°C 60°C，pH7. O 9. O，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解； (2)加碱性蛋白酶水解吸取250μ L 500 μ L酶液，维持反应温度30°C 60°C，pH7. O 9· 0，反应I 4小时； (3)灭活碱性蛋白酶，升温至80°C 100°C，维持15 30分钟； (4)沉淀酪蛋白用5mol/L盐酸调节pH到4.I 4. 6,使酪蛋白在其等电点处析出； (5)离心4000g IOOOOg离心力，离心5 30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液； (6)超滤取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽； (7)喷雾干燥取步骤(6)中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
2.如权利要求I所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤还包括有 在步骤(6)超滤后还包括有纳滤步骤取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；然后进行喷雾干燥步骤取纳滤回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
3.如权利要求I所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
4.如权利要求I所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所选用的酶制剂为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种。
全文摘要
本发明利用碱性蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抗氧化肽，属于生物技术领域。一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤(1)牦牛乳酪蛋白溶解；(2)加碱性蛋白酶水解；(3)灭活碱性蛋白酶；(4)沉淀酪蛋白；(5)离心；(6)超滤；(8)喷雾干燥。本发明制备的抗氧化肽，肽分子量小，结构简单，抗氧化活性高，1mg/mL的反应体系清除1,1～二苯基～2～苦基苯肼54.53%，清除羟自由基49.46%。
文档编号C12P21/06GK102787156SQ20121031554
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者何潇, 宋礼, 纪银莉, 苏艳萍, 葛静微, 谢小冬, 高维东 申请人:甘肃华羚生物技术研究中心