感性为63. 6 %，针对其他疾病的特异性为88. 8 % (245/276)，针对正常健康受试对象 的特异性为97. 5 % (199/204)。临界值设定为-2. 5个单位得到SLE的敏感性为98. 7 %，其 他风湿性疾病的特异性为24. 9% (正常健康者的特异性为5. 8% )。备选地，临界值设定 为+2. 5个单位得到SLE的敏感性为50. 0 %，其他风湿性疾病的特异性为96. 1 % (正常健 康者的特异性为100% )。
[0187] 表10 :层2中的指数值
[018 引
[0189] 整体性能特征一2层结合的
[0190] 层1与指数得分（只用临界值0)的组合产生了针对SLE的80. 3% (244/304)的 敏感性，W及在区分SLE与其他风湿性疾病中产生85. 5% (236/276)的特异性。区分SLE 与健康受试对象的特异性为97. 1% (199/205)。双层分析结合的结果示于表11中。
[0191] 表11 :结合的双层方法的整体性能
[0192]
[0194] 向基础模型中逐步加入CACAI^S和特异性成分
[0195] 此外，将双层方法的性能特征与未使用CBCAPs(EC4d和BC4d)和特异性成分r基 础模型"）而获得的性能特征比较。基础模型由双层分析、W及层1中的抗dsDNA和抗Sm 和层2中的ANA成分组成。CBCAPS和特异性成分的逐步加入示于表12中。如表13所示， 加入CBCAI^S和特异性成分会改善性能特征和基础模型，并且产生AUC为0. 894,并且区分 SLE与其他疾病的敏感性为80%、特异性为86%。抗体特异性成分使RA、原发性Sjogren 综合征、PM/DM和系统性硬皮病的诊断方法的特异性最大。区分正常受试对象与SLE的特 异性对于基础模型而言为90. 2 %，对于使用CBCAI^S的模型而言为94. 1 %，对于全模型而言 为 97. 1%。
[0196] 表12:模型比较
[0197]
[0201] 使用之前的方法进行组群分析和比较
[0202] 2个组群之间的敏感性差异（组1 = 81 %与组2 = 79% )不具有统计学意义（P =0. 652)(总体敏感性=80% )。此外，区分LSE与其他疾病的特异性差异不具有统计学 意义（组1 = 87%与组2 = 84%;p= 0. 485)(总体特异性=86% )。此外，我们还比较 了当前双层方法的性能特征与由当前检测得到的性能特征（表14)。加入结缔组织疾病特 异性的血清型标志物（SS-B/La，Scl-70,CENP，Jo-1)将诊断方法的特异性由64%改善至 79% (组合数据库：p= 0. 024)。
[020引表14:性能特征的比较[0204]
[0205] 指数的分析可重复性
[0206] 此外，在由11名SLE患者得到的总计19份样品中测定指数的逐日的可重复性。 对于具有多指数测定的患者而言，每隔一周收集血液。运些患者并非为临床验证研究的一 部分（组1和组2)。在连续3天中连续3次测定ANAXBCAI^S和抗体特异性成分的复合指 数。表15突出了日间的变化性。
[0207] 表15 :指数的分析变化性 [020引
[0209] 中值标准偏差为0. 12 (范围为0. 03至0. 26)。
[0210] 模棱两可的结果的定义
[0211] 根据模棱两可的ANA和特异性成分的模棱两可的指数结果
[0212] 由于构成指数得分的3种成分的2种成分（ANA和抗体特异性成分）与临界值 (ANA成分的值可W为〇、1或2 ;抗体特异性成分的值可W为0或1)有关，所W在ANA(20个 单位；60个单位）或形成特异性成分的各种标志物（抗CV[70个单位];SS-B/La[10个单 位]，CENP[10个单位]，化-1 [10个单位]或Sd-70 [10个单位])的医学决定极限下根据 分析误差所述的指数可W潜在地由阳性变为阴性（或者反之亦然）。例如表16中所示，在 10个单位的决定极限下，根据2个单位的SS-B/La差异巧与11个单位），所述的指数可W 由-1. 0 (情况2,SS-B/La= 9个单位；特异性成分=0)变成+1. 5 (情况1，SS-B/La= 11 个单位；特异性成分=1)。
[021引表16 :标志物水平对指数得分的影响[0214]
[0215] 由此断定当ANA和/或形成特异性成分的标志物接近临界值时（并由此能够潜在 地影响指数的阳性或阴性），必须定义指数的模棱两可的结果。当ANA的水平范围为16至 24个单位（在20个单位的临界值下，为20%CV)或者48至72个单位（在60个单位的 临界值下，为20%CV)时，我们定义了模棱两可的ANA成分。备选地，当抗MCV水平范围为 56至84个单位（在70个单位的临界值下，为20%CV)时或者当SSB-La，CENP，SC1-70和 化-1的范围为8至12个单位（在10个单位的临界值下，为20%CV)时，我们定义了模棱 两可的抗体特异性成分。
[0216] 如表17所示，指数值由阳性变成阴性还强烈地取决于指数方程式中的CBCAPS成 分。建立根据指数模棱两可的结果的决定规则。在所招募的794名受试对象中，其中总计 39名受试对象（4. 9% )呈现出模棱两可的结果。
[0217] 表17 :CBCAPS成分对模棱两可的定义的影响 阳21引
[0219]
[0220] 方法 [022UFACS测量
[022引使用批准的FACS检测来测量沉积在红细胞巧C4d)和B淋己细胞度C4d)上的C4d。
[0223]EC4d：使用Du化ecco憐酸盐缓冲盐水洗涂全血（50 y 1)，离屯、5分钟（800g) 并使用500 Jill%正常山羊血清溶液将红细胞团再次悬浮（Jackson Immunoresearch L油oratories, West Grove, PA)。随后，使用对抗人类C4d的纯化的小鼠单克隆抗体（小鼠 抗人C4d，如idel inc，San Diego)染色lOyl红细胞悬液，或者备选地使用非特异性小鼠 抗人IgGlK抗体在4°C下将所述的红细胞悬液染色45分钟。然后，如上所述洗涂样品。将 红细胞团在4°C下（在黑暗中）在溶液（25 y 1)中再次悬浮45分钟，其中所述的溶液包含 与异硫氯酸巧光素（F口C, Jackson ImmunoResearch L油oratories, West Grove, PA)缀合 的山羊抗小鼠抗体。染色后，使用250 yL冷的1%正常山羊血清溶液洗涂和再次悬浮红细 胞，经历FACS分析用于检测沉积在细胞表面上的C4d。
[0224] BC4d水平:在值用氯化锭基试齐 1| 度0F*ha;rmLyse,BDBioscience,SanJose,CA) 溶解由全血（700y1)得到的红细胞并离屯、（在800g下5分钟）后，将细胞团再次悬浮 于500iil1%正常山羊血清溶液，并使用单克隆C4d抗体染色（在2-8°C下，45分钟），如 上文所述。随后，使用上文所述的对抗人C4d的纯化的小鼠单克隆抗体或非特异性小鼠 抗人IgGlK抗体在4°C下将细胞悬液染色45分钟。使用山羊抗小鼠异硫氯酸巧 光素（門TC)抗体检测细胞表面C4d染色（在2-8°C下，45分钟，在黑暗中）。使用对抗人 CD-19 (CD-19与B细胞分化和成熟的所有阶段过程中表达的95kDaI型跨膜糖蛋白反应，其 与R-藻红蛋白（R-P巧缀合）的单克隆抗体来检测B淋己细胞特异性的C4d补体激活衍生 片段。
[0225] 所有的FACS分析均使用BeckmanCoulterF巧00血细胞计数仪和CXP软件 度eckmancoulter,化eaCA)。获得同种型背景的对照和各种补体蛋白质（C4d)的平均巧 光强度（MFI)，然后通过特异性MFI结果减去非特异性MFI来测定净MFI。使用由44名风 湿性疾病患者得到的血液在低、中和高强度下建立日间EC4d水平变化的（连续5天）中值 系数，并且对于EC4d而言，范围为3. 3至9. 6%。在患有风湿性疾病的34名患者中，在低、 中和高强度下日间BC4D变化的系数范围为5. 3至12. 1 %。在所有的FACS试验中，包括建 立流式细胞仪的合适的校准、补偿和线性的对照。
[0226] 对ANA、dsDNA和抗MCV的化ISA测量
[0227] 使用酶联免疫吸附检测巧LISA)来测量ANA、抗dsDNA和抗突变的瓜氨酸波形蛋 白抗体[抗MCV，抗瓜氨酸版抗体](16)。所用的所有化ISA方法都被化eUSFoodand DrugAdministration确认为安全且有效地用于体外诊断用途中DANA和抗dsDNA得自 INOVADiagnosticsQNOVA,SanDiego,CA)，而个MCV得自OrgentecDiagnostika,Germany。 在我们的临床试验中建立用于所有方法的日内和日间的变化系数，并且其化于20%。对于 所有的化ISA试验而言，包括合适的阳性和阴性对照。
[022引用于CENP，Jo-1，La/SS-B，Ro/SS-A，SC1-70,Smith的氣代酶免疫检测测量
[0229] 使用EliAIgG方法在Phadia250 仪器（ThermoFisher,Uppsala,Sweden)上在血 清或血浆中定性测量SS-A/Ro(60kDa，52kDa)，SS-B/La，着丝粒B(CENP)，Scl-70(抗拓朴异 构酶I)，Jo-1和Sm;Uh抗核IgG抗体。对于各种分析物而言，使用制造商建议的临界值。在 我们的临床试验中，对于所有分析物而言，分析再现性和可重复性化于20%。
[0230] 统计分析
[0231] 使用2. 15. 0版R软件来进行统计分析。根据需要对各种标志物使用受试者操作 曲线（单变量分析），而且还跟踪测定的指数值作为多变量逻猜回归方程式的输出。作为 性能的量度，计算敏感性和特异性（1-假阳性率）。使用k折交叉验证化=10)来计算所 报告的性能统计（敏感性、特异性、R0CAUC)，重复10次（所报告的结果为平均值）。此外， 使用3种其他的验证方法来计算性能特征（数据未示出），它们都与所报告的性能特征具 有极其相似的结果。3种其他的验证方法为弃一交叉验证，分离样品验证的平均值（3分之 2用于训练，3分之1用于验证），和表观验证（也称为重新代入）。在适当的情况下，通过 疾病分层来生成验证组（（书）ClinicalPredictionModels:APracticalApproachto Development,ValidationandUpdating.EwoutW.Steyerberg. 2009)〇
[0232] 参考文献
[0233] (1)民ahmanA,IsenbergDA.Systemiclupuserythematosus.NEnglJMed 2008 ;358巧）：929-939.
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[023引 （4)TanEM,C