MA)、25mm长的硝酸纤维素膜(millipore公司实验级135kit硝酸纤维素膜)、18mm长的样品垫(millipore公司生产级样品垫)以及25mm长的吸收垫(millipore公司生产级吸收垫)构成。粘贴于底板上的第一层为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜一端粘贴有样品垫(第二层)，另一端粘贴有吸收垫(第二层)，两层之间相互交错
2.5mm。构成该试纸条的所有部件长度不同，宽度均为5mm，组装完毕后根据需要切割至一定宽度即得到试纸条；
[0050]用于为超顺磁颗粒和炭疽芽孢提供反应环境的反应缓冲液的成分:40mMBS (ρΗ9.7) 1 % BSA ；
[0051]用于洗涤、重悬免疫反应产物并在展层时作为流动相的展层缓冲液的成分:10mMPBS(pH7.2)0.5% Tween-201 % BSA。
[0052]本发明所述的颗粒阻滞型磁性免疫层析的工作原理如图1所示:
[0053]颗粒阻滞型磁性免疫层析系统由两个部分组成，第一部分为样品的纯化与富集，第二部分为样品展层与信号读取。待测样品与抗体偶联超顺磁颗粒以1:20 (体积/体积)的比例混合，孵育一段时间后用磁力架进行分离。经过反复清洗，将磁分离获得的超顺磁颗粒及其捕获的抗原用一定量的展层缓冲液重悬并加入检测条带的样品垫。展层过程中，样品中的炭疽芽孢杆菌芽孢/营养体-抗体偶联超顺磁颗粒复合物由于体积过大而不能顺利展层，在靠近展层起始段形成阻滞条带，阻滞条带为黄色(如图2所示)，可肉眼直接观察，也可用仪器检测其光学、磁学信号。
[0054]以下实施例将对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好地理解本发明的目的，而不是限制本发明的保护范围。
[0055]实施例1:使用颗粒阻滞型磁性免疫层析法检测奶粉样品中的炭疽芽孢。
[0056]在0-15%的奶粉样品中，炭疽芽孢的检测下线为2X 104SpOreS/g ;当奶粉溶液为25%时，可检测的炭疽芽孢浓度低至6X 104SpOreS/g。已有检测技术在直接检测低浓度奶粉用品中的芽孢时10% )，灵敏度均低于本发明。此外，目前尚无检测技术可直接检测25 %奶粉样品中的炭疽芽孢，该浓度已经接近饱和浓度。
[0057]操作步骤如下:
[0058]将炭疽芽孢-奶粉样品用反应缓冲液混合，制成0-25%的奶粉乳浊液作为待测样品;
[0059]将100 μ 1的待检测样品与5 μ 1抗体偶联超顺磁颗粒工作液混合，室温静置孵育lOmin ；
[0060]磁力架分离出免疫复合物，并用展层缓冲液清洗两遍，最终用展层缓冲液重悬恢复至50 μ 1体积并将其加入检测试纸的样品垫；
[0061]经5min展层，目测观察试纸条上是否存在阻滞条带以定性判断奶粉样品中炭疽芽孢的含量，或利用光学检测仪器或磁性分析仪器，通过获取阻滞条带的光学信号或磁性信号来定量检测奶粉样品中炭疽芽孢的含量。
[0062]该方法所用组分及其制备方法如下:
[0063]抗体的制备:采用标准B淋巴细胞杂交瘤技术[Kohler G，Milstein C (1975)Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature256:495 - 497]制备针对炭疽芽孢表面EA1蛋白的单克隆抗体，并用正辛酸_饱和硫酸铵沉淀法对制备出的抗体进行纯化[Perosa F, Carbone R, Ferrone S, Dammacco F (1990)Purificat1n of human imunoglobulins by sequential precipitat1n with caprylic acidand ammonium sulphate.J Immunol Methodsl28:9 - 16.]；
[0064]抗体偶联超顺磁颗粒工作液的制备:使用含0.1 % (体积/体积)Tween20的50mM、pH4.7的醋酸钠缓冲液洗涤超顺磁颗粒(直径300nm)，加入EDC和NHS使终浓度均为20mM，室温反应一小时，洗涤超顺磁颗粒，加入针对炭疽芽孢表面EA1蛋白的特异性单克隆抗体使其与超顺磁颗粒含有的羧基的数量比例是1: 300到1:400，37°C摇床120rpm反应2小时，洗涤超顺磁颗粒，加入含有5 % (质量/体积)BSA的0.02Μ、ρΗ7.2的PBS，37°C摇床120rpm封闭2小时，使用含0.1% (体积/体积)TWeen20的50mM、pH4.7的醋酸钠缓冲液反复洗涤超顺磁颗粒，并将抗体偶联超顺磁颗粒转移至含1 % (质量/体积)PVP、1 % (质量/体积)BSA、0.5% (体积/体积)Tween20、5% (质量/体积)蔗糖的50mM ρΗ8.5硼酸缓冲液中保存，使抗体偶联超顺磁颗粒的浓度达到3mg/ml，置于4°C备用，即为抗体偶联超顺磁颗粒工作液；
[0065]检测试纸条的制备:该试纸条由98mm长的底板(millipore公司生产级底板)、25mm长的硝酸纤维素膜(millipore公司实验级135kit硝酸纤维素膜)、18_长的样品垫(millipore公司生产级样品垫)以及25mm长的吸收垫(millipore公司生产级吸收垫)构成。粘贴于底板上的第一层为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜一端粘贴有样品垫(第二层)，另一端粘贴有吸收垫(第二层)，两层之间相互交错2.5_。构成该试纸条的所有部件长度不同，宽度均为5mm，组装完毕后根据需要切割至一定宽度即得到试纸条；
[0066]用于为超顺磁颗粒和炭疽芽孢提供反应环境的反应缓冲液的成分:40mMBS (ρΗ9.7) 1 % BSA ；
[0067]用于洗涤、重悬免疫反应产物并在展层时作为流动相的展层缓冲液的成分:10mMPBS(pH7.2)0.5% Tween-201 % BSA。
[0068]实施例2:使用颗粒阻滞型磁性免疫层析法检测淀粉样品中的炭疽芽孢。
[0069]在彡5%淀粉样品中，炭疽芽孢的检测下线约为2X 104SpOreS/g ;当淀粉粉溶液为10%时，可检测的炭疽芽孢浓度低至2X 105spores/g。已有检测技术在直接检测低浓度奶粉用品中的芽孢时((5% )，灵敏度均低于本发明。此外，目前尚无检测技术可直接检测10 %淀粉样品中的炭疽芽孢，该浓度已经接近饱和浓度。
[0070]操作步骤如下:
[0071]将炭疽芽孢-淀粉样品用反应缓冲液混合，制成0-10%的淀粉悬浊液作为待测样品;
[0072]将100 μ 1的待检测样品与5 μ 1抗体偶联超顺磁颗粒工作液混合，室温静置孵育lOmin ；
[0073]磁力架分离出免疫复合物，并用展层缓冲液清洗两遍，最终用展层缓冲液重悬恢复至50 μ 1体积并将其加入检测试纸的样品垫；
[0074]经5min展层，目测观察试纸条上是否存在阻滞条带以定性判断奶粉样品中炭疽芽孢的含量，或利用光学检测仪器或磁性分析仪器，通过获取阻滞条带的光学信号或磁性信号来定量检测奶粉样品中炭疽芽孢的含量。
[0075]该方法所用组分及其制备方法如下:
[0076]同实施例1中所列组分及其制备方法。
[0077]实施例3:使用颗粒阻滞型磁性免疫层析法检测小苏打样品中的炭疽芽孢。
[0078]在5%小苏打溶液中，炭疽芽孢的检测下线为4X104spores/g ;在10%小苏打饱和溶液中，炭疽芽孢的检测下线为5X 104spores/g。目前尚无检测技术可直接检测小苏打溶液中的炭疽芽孢，通常需要复杂的样品预处理步骤。
[0079]操作步骤如下:
[0080]将炭疽芽孢-小苏打样品用反应缓冲液混合，制成0-10 %的小苏打溶液作为待测样品；
[0081]将100 μ 1的待检测样品与5 μ 1抗体偶联超顺磁颗粒工作液混合，室温静置孵育lOmin ；
[0082]磁力架分离出免疫复合物，并用展层缓冲液清洗两遍，最终用展层缓冲液重悬恢复至50 μ 1体积并将其加入检测试纸的样品垫；
[0083]经5min展层，撕去样品垫，目测观察试纸条上是否存在阻滞条带以定性判断奶粉样品中炭疽芽孢的含量，或利用光学检测仪器或磁性分析仪器，通过获取阻滞条带的光学信号或磁性信号来定量检测奶粉样品中炭疽芽孢的含量。
[0084]该方法所用组分及其制备方法如下:
[0085]同实施例1中所列组分及其制备方法。
【主权项】
1.一种颗粒阻滞型磁性免疫层析方法，其包括以下步骤: 1)混合待测样品和抗原特异抗体偶联超顺磁颗粒，并孵育； 2)磁分离获得捕获的抗原-超顺磁颗粒复合体； 3)将捕获的抗原-超顺磁颗粒复合体在样品垫上展层； 4)读取结果。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原为大小为0.1-20 μ m的颗粒，优选0.5-2 μ m的颗粒。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原为芽孢，细菌营养体，病毒。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育在反应缓冲液中进行，所述展层在展层缓冲液中进行。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述反应缓冲液的成分为40mMBS(pH9.7) 1 %BSA，所述展层缓冲液的成分为 10mMPBS(pH7.2)0.5% Tween-201 % BSA。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中在步骤4)中通过肉眼直接观察或检测光学、磁学信号读取结果。8.一种颗粒阻滞型磁性免疫层析试纸条，其包括底板、粘附于底板上的硝酸纤维素膜、粘贴在硝酸纤维素膜一端的样品垫和另一端的吸收垫，其特征在于:所述试纸条不包含结合垫，且硝酸纤维素膜上无捕获抗体。9.制备权利要求8所述的试纸条的方法，其包括如下步骤:在底板上粘贴硝酸纤维素膜作为第一层，在硝酸纤维素膜一端粘贴样品垫作为第二层，另一端粘贴吸收垫作为第二层，两层之间相互交错2.5_，组装完毕后根据需要切割至一定宽度即得到试纸条。10.权利要求8所述的颗粒阻滞型磁性免疫层析试纸条用于定性和/或定量检测目的抗原的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种颗粒阻滞型新型磁免疫层析方法，包括混合待测样品和抗原特异抗体偶联超顺磁颗粒，并孵育；磁分离获得捕获的抗原-超顺磁颗粒复合体并在样品垫上展层；和读取结果的步骤。与已有免疫层析试纸条不同，本发明的方法无结合垫，无固定于硝酸纤维素膜的捕获蛋白等，并可同时实现光信号、磁信号及裸眼检测。本发明不仅适用于炭疽芽孢杆菌芽孢的现场检测，而且可用于其它大尺寸分析物的检测。
【IPC分类】G01N33/558, G01N33/569
【公开号】CN105301239
【申请号】CN201410283244
【发明人】张先恩, 王殿冰, 田博, 张治平
【申请人】中国科学院生物物理研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年6月23日