一种米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法，属于仪器检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 米酵菌酸度ongkrekicacid，RA)是挪毒假单胞菌产生的一种毒素，食入该毒素污 染的食物可引起人或动物中毒，重者可致死亡。20世纪30年代研究人员从引起人中毒的挪 子发酵食品样品中提取出该毒素，并对该毒素的理化性质和致毒机制进行了大量研究，近 年来米酵菌酸又作为研究抗肿瘤疾病和细胞调亡的一种工具试剂来使用。我国70年代从 酵米面中毒样品中分离出一种称为"酵米面黄杆菌"（Flawbacwteriumfarinofennentans nosp)的食物中毒菌，其产生的外毒素-酵米面黄杆菌毒素A(简称黄杆菌毒素A, flavotoxinA)现证明即为米酵菌酸。
[0003] 米酵菌酸是挪毒假单胞菌产生的一种毒素，食用被其污染的酵米面和变质鲜银 耳常引起中毒，其分子式〔2化8〇7,分子量486. 61，化学名为3-簇甲基-17-甲氧基-6、18、 21-Ξ甲基二十二碳-2、4、8、12、14、18、20-屯締二酸。对人动物和多种真菌有毒，对热稳 定，因而熟食也可中毒，而对酸性条件、氧化剂和日光不稳定。
[0004] 米酵菌酸作为酵米面中毒和银耳中毒的病原菌产牛的毒素之一，具有很强的生物 活性，是挪毒假单胞前引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物。临床症状表现为恶屯、呕 吐、腹痛腹胀等，重者出现黄痘、腹水、皮下出血、惊厥、抽摇、血尿、血便等肝脑肾实质性器 官损害症状。动物实验亦表明，米酵菌酸主要作用于肝、脑和肾等实质性脏器且W细胞内的 线粒体最为敏感。 阳0化]米酵菌酸的毒性最早认为是干扰糖代谢，W后人们一直研究其机制。1959年Welling等通过动物试验发现米酵菌酸可抑制丙酬酸、α -酬戊二酸和苹果酸的氧化，对憐 酸化过程的抑制更为明显。1970年化ndersonW大鼠线粒体为材料证明了对氧化憐酸化的 抑制部位不在呼吸链，而是线粒体膜上的ADP转运过程。Weldemamt发现米酵菌酸增加ADP 与线粒体内膜的亲合力，阻断ADP转运。La叫uin则证明米酵菌酸在线粒体内膜上与ADP载 体形成复合物。于是吴洪娟认为由于米酵菌酸与腺嚷岭载体ANT(电压依赖性阴离子通道） 的结合，成为ANT的特异性非竞争性抑制剂，阻碍了ADP与ATP在线粒体内膜的交换，使ATP 生成减少或消失；由于缺乏ATP，细胞膜上的离子累不能发挥正常功能而效率低下，引起细 胞内水钢滞留，细胞水肿；线粒体内膜依赖ATT'的机制停止工作，造成水钢滞留，从而引起 线粒体肿胀，崎变短、模糊直至消失。作为细胞内进行呼吸作用和能量交换的重要场所及细 胞内主要的供能器官--线粒体，它的功能消失必将导致细胞、机体的死亡。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简便、定性定量能力较强的米酵 菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法，根据米酵菌酸的肉酸性特性，本发明采用弱阴离子 交换柱，吸附剂上修复的是强碱性基团，保留弱酸性物质粒径33μπι，孔径85μπι，表面积 800m2/g，离子容量 0. 60meq/g。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供的米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤：
[0009] (1)样品前处理
[0010] 准确称取经过粉碎、均质过的待检测样品2.Og，加入20血甲醇溶液均质提取米酵 菌酸，再加入0. 5g氯化钢；W上样品密闭避光振荡比，再超声10min，4000;r/min离屯、3min， 取上清液。
[0011] 似富集和净化 阳01引首先W1血甲醇和1血超纯水活化弱阴离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴 /秒，取2mL上清液过弱阴离子交换柱进行富集，流速控制在1滴/秒，接着再W25mM乙酸 锭（P册-7)溶液和甲醇各ImL淋洗弱阴离子交换柱，W去除杂质，最后WImL5%甲酸甲醇 溶液洗脱米酵菌酸，待液相色谱-串联质谱化C-MS/M巧检测。 阳01引 做LC-MS/MS检测
[0014] 液相条件PhenomenexC18 色谱柱（3.OmmX150mm，5μm)，柱溫 30°C;进样量 ΙΟμΙ;流动相A为水（含有0. 1%甲酸，5mmol/L甲酸锭），B为95%乙腊（含有0. 1%甲 酸，5mmol/L甲酸锭）；梯度洗脱条件见表1 :
[0015] 表1梯度洗脱条件
[0016]
[0017] 质谱条件离子化方式为电喷雾离子化负模式巧SI-);多反应监测模式(MRM);碰 撞气压力（CAD) :6巧帘气压力（CUR) :10 ;电喷雾电压（I巧：-4500V;离子源溫度灯EM): 600 °C。
[0018] 化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示。
[0019] 表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数表
[0020]
[0021] *为定量离子
[0022] 液相色谱-质谱检测时，由于基质效应的影响，导致目标化合物发生离子增强或 抑制作用，采用不含目标待测物得基质空白溶液配制梯度混合标准品溶液（0,10. 〇,20. 0， 50. 0,100. 0,200. 0μg/kg)。按照上述分析条件测定，W峰面积对浓度线性回归。超出线性 范围的样品需要稀释后重新测定。标准曲线见图6、7。
[0023] 表4标准曲线及线性关系
[0024]
[0025] 试样中米酵菌酸色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范 围应在±2. 5%之内。米酵菌酸的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(S/ N> 3)，定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10 (S/N> 10)，米酵菌酸的检测低 限为 50μg/kg。
[00%] 本发明的方法操作简便、定性定量能力较强，可作为检测银耳食品质量和评估食 品安全风险的可靠方法。在质谱MRM参数上，本方法采用米酵菌酸带单电荷的[M-田485.0 分子离子作为母离子。
【附图说明】
[0027] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0028] 图1为米酵菌酸的[M-田母离子质谱图。
[0029] 图2为米酵菌酸W[M-田离子作为母离子情况下，确定两对离子对，485. 0/397. 1 和 485. 0/441. 4。
[0030] 图3为米酵菌酸标准品总离子流图。
[0031] 图4离子对485. 0/441. 4的标准曲线。
[0032] 图5离子对485. 0/397. 1的标准曲线。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1母离子的选择
[0034] 本发明的米酵菌酸质谱检测方法采用[M-田离子作为母离子，结果表明米酵菌酸 的[M-田离子作为母离子可W得到响应很强的二级离子碎片，其质谱检测灵敏度明显高于 现有检测方法。
[0035] 实施例2样品前处理条件
[0036] 样品前处理
[0037] 本实施例是W银耳样品为基础。
[0038] 准确称取经过粉碎、均质过的银耳样品2.Og，加入甲醇溶液均质提取米酵菌 酸，再加入0. 5g氯化钢；W上样品密闭避光振荡比，再超声10min，4000;r/min离屯、3min，取 上清液待用。
[0039] 富集和净化 W40] 首先WImL甲醇和ImL超纯水活化弱阴离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴 /秒，取2mL上清液过弱阴离子交换柱