一种检测ad的方法及尿液多肽组ad生物标记物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及AD生物标记物技术领域，尤其涉及一种检测AD的方法及尿液多肽组AD生物标记物。
【背景技术】
[0002]作为老年痴呆症的最常见类型，阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一种由于大脑神经细胞死亡而导致的神经退行性疾病，因由德国精神病学家和神经病理学家Alois Alzheimer于1907年首先报道而命名。AD症的临床表现为认知功能衰退、记忆力下降、智力恶化和日常生活能力不断减退，并伴随有各种神经精神异常和行为障碍。因此，与绝大多数其它疾病不同，AD症所丧失的是情感和尊严等人类的本质特征。美国阿尔茨海默病协会(Alzhermer’ s Associat1n)统计，到2000年，美国65岁以上人口占总人口的比例约为4.5%，当年美国新增AD症患者为41.1万。十年后的2010年，以上两个数字分别增至5.1%和45.4万。截至2012年，全世界大约有3560万名AD患者，占世界总人口的0.5%。根据《2010年世界阿尔茨海默病》报告的数据，全世界老年痴呆症的人数每20年将增加1倍。流行病学研究表明，在发达国家老年痴呆症患者的人数呈线性增加，但是，在低收入国家老年痴呆症患者的人数呈现的却是指数增加的态势。我国老年人口基数众多，老龄化速度加快的同时AD的发病率逐年增长，预计在未来50年内我国AD的发病率将会增加3倍。2011?2015年，全国60岁以上老年人将由1.78亿增加到2.21亿，平均每年增加老年人860万；老年人口比重将由13.3%增加到16%。《中国老龄事业发展“十二五”规划》指出:未来20年，我国人口老龄化日益加重，到2030年全国老年人口规模将会翻一番。但是，AD症尚未引起中国社会的足够重视，例如，病人的就诊率偏低，很多人没有将其作为一种疾病，也没有意识到AD带来的社会、经济、医疗护理的负担将日益严峻。
[0003]AD主要的病理特征为老年斑(senile plaque，SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)及神经元和神经突触的丢失。老年斑的主要成分是β -淀粉样蛋白(β -amyloid, Αβ )，主要存在于大脑皮质、神经节、白质、脑干和小脑中，老年斑的周围缠绕退化的神经元和神经轴突。但总体上AD是由多种病发因素引起的综合性疾病，这也可以解释为什么十年来以单一靶点为目标的包括抗体、疫苗和小分子在内的药物都失败在III期临床，无一成功。目前临床上使用的安理申等西药对治疗AD症有一定作用，但也只限于早期患者，并且不能停药，一旦停药之后患者病情急剧恶化。目前AD尚无法治愈，预防和延缓AD的发生是控制AD的最可行的有效途径。AD按照病情发展程度可分为临床前阶段、轻度认知障碍、早期痴呆、中期痴呆和重度痴呆。但是，AD的病理学改变有可能在出现认知功能障碍的5-10年就已经发生，因此，发现有效的AD早期诊断标志物对AD的预防和延缓至关重要。
[0004]AD最显著的病理学特征是脑内的淀粉样蛋白沉积和神经纤维缠结，其产生原因分别是淀粉样蛋白和微管相关蛋白Tau的过度磷酸化，因此，脑脊液中淀粉样蛋白、总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的水平以及它们的组合被认为是AD生物标志物的最主要标志。但是，脑脊液检测的创伤性限制了该标志物的应用，特别是在无明显认知功能障碍时，对脑脊液检测的抵触甚至大于对AD症的关切。另外，在不同实验室之间甚至同一实验室之内这些检测结果的变动很大。
[0005]多肽组学是以机体内源性多肽和低分子量蛋白质为研究对象，研究多肽组的成分、功能、变化规律及其相关关系。蛋白质是生命功能的执行者和体现者，蛋白质代谢的异常也会通过其在体内的降解在多肽组学的水平反映出来。对于AD症等慢性疾病，蛋白质分子水平的变化往往早于临床症状的改变。但是，现有技术中不存在应用多肽组以寻找简单和无创的AD生物标志物。
[0006]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0007]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测AD的方法及尿液多肽组AD生物标记物，旨在解决现有AD生物标记物应用受到限制和检测结果变动很大的问题。
[0008]本发明的技术方案如下:
一种AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述尿液多肽组AD生物标记物为组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
[0009]所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述组蛋白降解产物为HistoneH2B，Histone H2A，Histone Η3.2，Histone Η4，Histone H2B type 1_J，Histone H1.2，Histone H3.1t，Histone H1.4，Histone H2A.Z 和 Histone H1.5 中的一种或多种。
[0010]所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述炎症蛋白降解产物为Alpha-l-antichymotrypsin? Osteopontin， Protein S100-A8， Protein S100-A12 和Ceruloplasmin中的一种或多种。
[0011]所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述能量代谢蛋白降解产物为 Transketolase 降解产物，Pyruvate kinase isozymes M1/M2 降解产物，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 降解产物，Phosphoglycerate kinase 1 降解产物和Cathepsin G的降解产物中的一种或多种。
[0012]所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述尿液多肽组AD生物标记物还包括 Haptoglobin，Apolipoprotein A_I，Vimentin，Ig lambda-2 chain C reg1ns，Thymosin beta—4，Actin，Beta-2_microglobulin ，Plasma serine protease inhibitor，Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4， Carboxypeptidase B2 和 Fibrinogenbeta chain中的一种或多种。
[0013]一种基于如上任一所述AD的尿液多肽组AD生物标记物检测AD的方法，其中，包括步骤:
A、取1.0?2.0mLAD患者的尿液样品，离心10?15min后取上清，按照上清尿液30 mg/mL与LaGM复合材料=(40?60):1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋后室温振荡10?15min ；
B、离心5?lOmin，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入450?500uL水，充分涡旋后室温振荡5?lOmin，离心，磁分离，去掉上清，重复2次； C、在步骤B去上清后的沉淀中加入20uL80%+l%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D、检测步骤C得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
[0014]所述的检测AD的方法，其中，包括步骤:
A’、取1.5mLAD患者的尿液样品，lOOOOrpm离心lOmin后取上清，按照上清尿液30 mg/mL与LaGM复合材料=50:1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋2min后1000r室温振荡 lOmin ；
B’、10000r离心5min，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入500uL水，充分涡旋lmin,室温振荡5min，10000r离心5min磁分离，去掉上清，重复2次；
C’、在步骤B’去上清后的沉淀中加入20uL80%+l%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D’、检测步骤C’得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
[0015]所述的检测AD的方法，其中，所述步骤DSD’中，还包括检测步骤CSC’得到的检测尿液中是否存在 Haptoglobin，Apolipoprotein A_I，Vimentin，Ig lambda-2 chainC reg1ns，Thymosin beta-4, Actin, Beta-2-microglobulin，Plasma serine proteaseinhibitor， Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4， Carboxypeptidase B2 和Fibrinogen beta chain 中的一种或多种。
[0016]所述的检测AD的方法，其中，所述步骤D或D’中，通过液相色谱-TripleTOF质谱分析对检测尿液进行检测。
[0017]所述的检测AD的方法，其中，所述液相色谱-