一种基于碳纳米复合材料的生物传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于碳纳米复合材料的光电免疫生物传感器及其制备方法，属于 生物传感器技术领域。
【背景技术】
[0002] 生物传感器是目前生命科学及临床医学测试方法研究中最为活跃的领域之一，已 广泛用于临床、工业、环境和农业分析等领域。20世纪90年代以来，纳米技术的介入为生物 传感器的发展提供了新的活力，并已取得了突破性的进展。纳米材料由于比表面积大、表 面反应活性高、表面原子配位不全等导致表面的活性位点增加、催化效率提高、吸附能力增 强，为生物传感研究提供了新研究途径。与传统的传感器相比，新型纳米材料传感器不仅 体积更小、速度更快、而且精度更高、可靠性更好。由于纳米粒子高的比表面积和其本身的 生物兼容性，在生物电催化反应中起着重要作用。例如与纳米粒子组装后的酶，其活性中 心可更接近电极表面，易于进行电子转移，提高了生物电催化活性，使其更有利于在电化 学传感器中应用。碳纳米材料因其独特的性能如价格低廉、来源广泛、易于功能化、优异的 电子性质、高力学强度和广阔的应用前景而备受关注。
[0003]目前，传统用于光电生物传感的光电探针材料多为金属化合物，尽管这类材料具 有优异的光电转换性能，但是它们往往具有较强的氧化性或较高的毒性，容易对生物分子 或生物体造成损伤，并且在长期光照下，此类化合物容易发生自腐蚀（光照下自身不稳 定）。
[0004] 光电化学生物分析是近年来新出现并迅速发展起来的一种分析方法，它是一种 基于传统电化学的分析技术。该分析技术定量的基础依赖于待测物与光电化学活性物质之 间的物理、化学相互作用产生的光电流或光电压的变化与待测物的浓度之间的关系。因此， 这种方法继承了传统电化学分析的诸多优点，如价格低廉，设备简单，灵敏度高等，同时 又具有一些在传统电化学平台上难以实现的优点。例如，该方法采用光和电两种不同的方 式作为信号的激发和检测手段，两者不会互相干扰，背景低，灵敏度高。
[0005] 近年来，碳纳米材料，例如碳纳米管、石墨烯、石墨烯量子点、碳点等也被大量用于 光电分析生物传感领域的研究，除了不含有金属元素、来源广泛、生物相容性好和环境友好 等优势外，它们还表现出优异的界面调控、电子传导和能量共振转移能力。相比之下，作为 碳的另一种同素异形体，富勒烯材料（例如C60、C70等）直接用于光电分析生物传感领域 的研究非常少。
【发明内容】
[0006] 发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于碳纳米复合材料的光 电免疫生物传感器及其制备方法。
[0007] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明公开了一种基于碳纳米复合材料的光 电免疫生物传感器，所述生物传感器的平台包括以下部分：电极、紧贴电极表面的捕获抗体 层、待测抗原层以及检测抗体层，所述待测抗原层位于捕获抗体层和检测抗体层中间；
[0008] 所述检测抗体层是由二抗复合体所制成，所述二抗复合体是由检测抗体和碳纳米 复合材料相互偶联所制成。
[0009] 作为优选，所述捕获抗体层是由捕获抗体和氧化石墨烯所制成。
[0010] 作为另一种优选，所述碳纳米复合材料是由富勒稀和氧化石墨稀所制成的复合材 料。
[0011] 作为进一步优选，所述富勒烯和氧化石墨烯的重量比为1:1。
[0012] 作为另一种优选，所述二抗复合体的制备方法包括以下步骤：
[0013] (1)PTC_NH2的制备：
[0014] 称取茈四羧酸二酐，加入乙醇，搅拌，向其逐滴流加乙二胺试剂，继续搅拌过夜，离 心之后取沉淀，分别用乙醇、超纯水超声洗涤离心，室温干燥，得到ptc-nh2后遮光保存；
[0015] (2)C60-G0-PTC-NH2的制备：
[0016] 称取富勒烯C60、氧化石墨烯G0、上述PTC-NH2，研磨成细粉状，转移至PBS中，经过 超声分散后，室温下连续搅拌过夜，得到C60-G0-PTC-NH2;
[0017] (3)制备二抗复合体：
[0018] 取上述C60-G0-PTC-NH2，加EDC/NHS，室温下避光搅拌，离心洗涤，将沉淀重悬至 PBS之中，向上述溶液中加入检测抗体，4°C避光搅拌，用PBS离心洗涤，将沉淀重悬到PBS 中，4 °C避光保存，即得所述二抗复合体。
[0019] 进一步优选，所述二抗复合体的制备方法包括以下步骤：
[0020] (1)PTC_NH2的制备：
[0021] 称取0. 5g茈四羧酸二酐（PTCDA，一种水溶性染料），加入2. 5ml乙醇，于4°C搅拌 lh后，向其逐滴流加乙二胺试剂5ml，继续搅拌过夜，离心之后取沉淀，分别用乙醇、超纯水 超声洗涤离心两次，室温干燥，得到PTC-NH2后遮光保存。
[0023] (2)C60-G0-PTC_NH2的制备：
[0024] 称取C60、G0、上述？1^-见12各0.5mg，于研钵中研磨成细粉状转移至1ml0. 01M PBS中。经过lmin超声分散后，室温下连续搅拌过夜，得到C60-G0-PTC-NH2。
[0025]
[0026] (3)制备二抗复合体：
[0027]取C60-G0-PTC-NH2500ul，加EDC/NHS500ul(EDC、NHS的浓度分别为 20mg/ml和 40mg/ml)，室温下避光搅拌lh，离心洗涤，将沉淀重悬至500ul0. 01MPBS之中。向上述溶 液中加入150ul4ug/ml二抗（Ab2,检测抗体），4°C避光搅拌5h后，用0.01MPBS离心洗涤， 将沉淀重悬到500ul0. 01MPBS中，4°C避光保存，即得所述二抗复合体。
[0028]
[0029] 作为另一种优选，所述电极为氧化烟锡电极。
[0030] 本发明还提供了所述光电免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤：
[0031] (1)滴加氧化石墨烯G0 :在电极表面滴加氧化石墨烯G0,使其完全结合在电极表 面；
[0032] (2)活化氧化石墨烯G0 :利用催化剂，使氧化石墨烯G0上的羧基完全活化；
[0033] (3)共价连接捕获抗体：向上述活化的氧化石墨稀G0表面滴加捕获抗体，使捕获 抗体与氧化石墨稀G0充分连接；
[0034] (4)封闭非特异性位点：封闭氧化石墨烯G0未被捕获抗体结合的位点，形成捕获 抗体层；
[0035] (5)捕获介质中的待测抗原：向上述捕获抗体层滴加待测抗原，充分反应，得待测 抗原层；
[0036] (6)检测抗体层制备：洗去上述未结合的待测抗原，晾干，滴加所述二抗复合体， 进行避光，室温反应，得检测抗体层，通过二抗复合体光电流的强弱变化来检测抗原的量。
[0037] 作为优选，所述的光电免疫生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0038] (1)滴加氧化石墨烯G0 :取氧化石墨烯G0,分散在PBS中，滴加到经过处理的氧化 烟锡电极表面，室温下放置，直至其完全结合在电极表面；
[0039] (2)活化氧化石墨烯G0 :将上述加了G0的电极在PBS溶液中涮洗，洗去未结合在 电极表面的G0,滴加EDC/NHS，室温放置，使G0上的羧基完全被活化；
[0040] (3)共价连接捕获抗体：将步骤（2)所得电极在PBS溶液中涮洗，洗去未利用的 EDC/NHS，晾干，滴加捕获抗体，4°C下反应，使捕获抗体和G0充分连接；
[0041] (4)封闭非特异性位点：将步骤（3)所得电极在PBS溶液中涮洗，洗去未结合的捕 获抗体，晾干，滴加牛血清白蛋白（BSA)，室温放置，封闭未被捕获抗体结合的位点，形成捕 获抗体层；
[0042] (5)捕获介质中的待测抗原：将步骤⑷所得电极在PBS溶液中涮洗，洗去多余的 BSA，晾干，滴加抗原，室温反应，得待测抗原层；
[0043] (6)检测抗体层制备：将步骤（5)所得电极在PBS溶液中涮洗，洗去未结合的抗 原，晾干，滴加所述二抗复合体，进行避光，室温反应，得检测抗体层，通过二抗复合体光电 流的强弱变化来检测抗原量。
[0044] 作为进一步优选，所述的光电免疫生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0045] (1)滴加氧化石墨烯G0 :取(λ5mg/mlG0((X01MPBS) 10ul，小心滴加到经过处