择性。
[0028] 发明的优点与效果
[0029] 在最佳实验条件下，研究了不同浓度ATP与信号强度之间的关系，得到了检测ATP 的标准曲线，线性范围及线性方程。当ATP的浓度在1.0 X 1 0-8~1.0 X 10、之间时，体系的 信号强度随着ΑΤΡ浓度的增大而增大（图3)。得到ΑΤΡ的线性回归方程为Δ ip = 〇.6536C+ 15.584( Aip为体系的信号强度;C为ATP的浓度，l(T8M;n = 7，R = 0.999)。该方法检测限为 3.0 X 10-9Μ(3σ)。对浓度1.〇 X 10-7M的ATP进行7次平行重复测定的RSD为3.7%，表明本法有 较好的重现性。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不构成对发明的进一步限制。
[0031 ] 实施例1 MB-DNA1用量对电化学信号的影响
[0032] MB-DNA1作为载体，用于固定探针。首先固定探针溶液用量，考察了MB-DNA1溶液用 量变化时，检测信号的变化。实验结果显示，检测信号随着MB-DNA1溶液用量的增加而增强； 用量大于75yL，信号变化趋势变缓（图2(A))。因此，实验选取75yL为MB-DNA1溶液的最佳用 量。
[0033]实施例2探针用量对电化学信号的影响
[0034]当固定MB-DNA1溶液用量为75yL时，考察了探针用量对信号强度的影响，随着探针 用量的增加，检测信号逐渐增强，当探针用量为90yL时，信号最大（图2(B))。因此，实验选取 9〇yL作为探针的最佳用量。
[0035]实施例3 ATP与适体结合时间对电化学信号的影响
[0036]实验考查了ATP与适体结合时间对信号强度的影响，信号强度随着结合时间的增 长而快速增强，在40min时信号强度达到最大，之后趋于平稳，由此可见40min足够用于ATP 与适体结合(图2(C))。因此，实验选取40min作为最佳结合时间。
[0037] 实施例4方法的选择性
[0038] 选择性的好坏是决定方法是否可行的必要因素。考察了所建立的方法检测ATP的 选择性。利用该方法在同一实验条件下检测的ATP及其一定浓度相关活性小分子物质。当 ATP浓度为7.0 X 1(T7M，GTP、UTP和CTP浓度为7.0 X 10-5Μ时，检测结果如图4所示。浓度为7.0 X 10-7Μ的ΑΤΡ产生强的电化学信号，而GTP、UTP和CTP的所产生的信号比ΑΤΡ弱许多（图4)。由 此证明，在该检测体系中，GTP、UTP和CTP这些活性小分子物质不会对ATP的检测产生影响， 方法的选择性很好，可以用于实际样品的检测。
[0039]实施例5方法检测运动小鼠心肌ATP含量
[0040]进一步将该方法应用于实际样品中ATP含量的检测中。根据发明的方法对小鼠心 肌ATP含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为93.5_ 98.7%，测定结果见表1，本发明的方法在ATP检测中具有精密度高的特点。同时做了运动前 后小鼠心肌ATP含量检测。结果表明，运动前小鼠心肌的ATP含量为3.33 ±0.56yM/g，运动后 小鼠心肌ATP含量为1.06 ± 0.29yM/g。实验结果显示，运动后小鼠心肌ATP含量降低。
[0041 ] 表1.小鼠心肌ATP含量测定结果
[0042]
[0043] an = 7 序列表 SEQUENCE LISTING <110>青岛科技大学 、120> -种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法 <、160> 3 <170> Patcntlri version 3.3 <210 1 <21!> 27 <212> DNA <213>人工系列 <400> 1
[0044] Λ 。 acciggggga gtattgcgga ggaaggt 27 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <2]_3>人工系列 <400> 2 U1UCCCCC UlCCCCCtl icccccitic cccc 34 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213>人工系列 <400> 3 Icctlcctcc gcaatgiccc cccaaac 27
【主权项】
1. 一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法，包括以下步骤： (1) 金纳米粒子的制备 制备金纳米粒子所用的玻璃容器容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等用王水浸泡30分钟， 然后用二次水冲洗干净，烘干备用；在250mL圆底烧瓶中加入100mL，0.01%的HAuCl4,搅拌 加热至沸腾，然后快速加入500yL，1 %的Na3C6H5〇7,再加热10分钟，搅拌15分钟，冷却至室 温，转移在棕色瓶中保存； (2) 探针 CV/DNA2/DNA3/AuNPs 的制备 在2mL的离心管中加入 10yL 1.0X10-5M的DNA3、30yL 1.0X10-5M的DNA2和 10yL pH 5.2 的醋酸缓冲溶液以及l〇yL 10mM的TCEP反应lh;随后向其中加入制备好的lmL的AuNPs溶液， 放入摇床轻摇反应16h;使巯基DNA与AuNPs通过Au-S键连接起来，生成DNA2/DNA3/AuNPs;再 向其中加入过量的CV溶液，37°C条件下恒温反应65min，生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs; (3) MB-DNA1 的制备 取l〇yL羧基化磁珠至lmL的小离心管管中，并用100yL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液清 洗两遍，并分散于Tris-HCl缓冲溶液中得磁珠悬浮液;将40mM EDC和10mM NHS加到处理好 的磁珠悬浮液中，将该混合物在室温下轻摇lh;然后，将50yL，5.0 X 10_6M的DNA1加到上述所 得溶液中；在4°C条件下，振动反应12h;反应完成后，将所得产物经过磁性分离，并将得到的 0嫩1修饰磁珠产物1^-0嫩1分散在1!1^口!17.4的1^8-!1(：1缓冲溶液中 ； (4) ATP的检测 在1.5mL样品管中加入制备好的100yL探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs溶液以及100yL MB-DNA1溶液，反应lh;然后用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗三次，并将其分散在lmL pH 7.4的 Tris-HCl缓冲溶液中；然后将含有不同浓度的ATP溶液加入，在37°C条件下反应一定时间， 经过磁性分离，取磁性分离清液l〇yL均匀滴涂在工作电极上，室温下静置1小时，然后进行 电化学测定;在室温下将三电极体系放在含有10mM K3[Fe(CN)6]和0.5M KC1溶液中进行表 征;利用差分脉冲伏安法在含〇. 1M KC1的pH 8.0的磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速扫描， 电位扫描范围为-0.7~0.1 V; 优选的，所述的0财1的部分序列为：5'-冊2-(〇12)6-厶〇：了66 666厶6了厶17 606 6八6 GAAGGT-3，； 优选的，所述的DNA2的部分序列为：5'-SH-(CH2)6-TTT TTC CCC CTT TCC CCC TTT CCC CCT TTC CCC C-3,； 优选的，所述的 DNA3 的部分序列为：5'-SH-(CH2)6-TCC TTC CTC CGC AAT GTC CCC CCAAAC-3,。2. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的 方法，其特征在于所述的电化学工作站为上海辰华仪器公司的CHI660B电化学工作站;高速 离心机为上海市安亭科学仪器厂的Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机;恒温振荡器为全坛市 医疗仪器厂的Z-82A气浴恒温振荡器;酸度计为上海雷磁仪器厂的PHS-3D型酸度计;实验采 用三电极系统:金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对 电极。3. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的 方法，其特征在于所述羧基化磁珠的浓度为25mg/mL、粒径为100nm的溶液购于阿拉丁试剂 有限公司；三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP、三羟甲基氨基甲烷Tris等购自上海化学试剂有限 公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS购自Sigma 公司；氯金酸HAuCl4,柠檬酸三钠 Na3C6H5〇7均购于天津市博迪化工有限公司；Tris-HCl缓冲 溶液包含l〇〇mM Tris,体积分数为0.1%Tween 20和1M NaCl〇
【专利摘要】本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法。首先，将羧基化磁珠MB与氨基修饰的ATP适体DNA1结合生成MB-DNA1复合物，随后使得修饰有SH的CV适体DNA2、ATP适体互补链DNA3与纳米金结合，并加入CV生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs，然后，MB-DNA1复合物与探针反应，通过DNA1与DNA3结互补作用，生成探针修饰的磁珠。接着向探针修饰的磁珠溶液中加入含ATP的样品溶液，之后进行磁分离，取上清液。随后，将上清液滴在金纳米粒子修饰的电极上。将所得到的电极作为工作电极同参比电极、指示电极插入电解质溶液中，进行电化学测定。根据电化学信号强弱，实现ATP含量的测定。
【IPC分类】G01N27/327, G01N27/48
【公开号】CN105510420
【申请号】CN201510964170
【发明人】混旭, 岳美娥, 宗迎夏
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月20日