基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型的葡萄糖含量快速检测方法和检测试剂盒，尤其涉及一种基 于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测方法及其检测试剂盒，属于分析化学和纳米技术 领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖是一种能直接吸收利用，补充热能的碳水化合物，是人体所需能量的主要 来源，在体内被氧化成二氧化碳和水，并同时供给热量，或以糖原形式贮存。能促进肝脏的 解毒功能，对肝脏有保护作用，是生物体内最为常见的能源物资。而血清中的糖称为血糖， 绝大多数情况下都是葡萄糖。体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自葡萄糖，因此人 体内血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。随着人们的生活水平的 提高和人口老龄化的加重，越来越多的人容易患上高血糖，而血糖值过高会引起口渴、乏 力、尿多、多食、严重的则可导致头晕、糖尿病、肾脏衰竭，身体各项机能紊乱，不采取及时治 疗措施甚至导致死亡。而今用于治疗糖尿病的胰岛素价格贵、依赖性强，因此对于血糖值的 准确快速检测对于高血糖的降糖以及糖尿病的预防有着重要的意义。
[0003] 本发明基于铂铋纳米模拟过氧化物酶，提供了一种比色检测葡萄糖的方法及检测 试剂盒。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的在于提供一种基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测方 法。其中包括利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成过氧化氢，铂铋纳米模拟过氧化物酶 催化过氧化氢氧化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和N-乙基-N-( 2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐偶合显色，显色体系的最大吸收波长为590 nm，由590 nm处吸光度可得出葡 萄糖的含量。
[0005] 为了实现上述检测方法的目的，本发明采用以下技术方案： 本发明所述的一种基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测方法，其特征是将葡萄 糖氧化酶，葡萄糖溶液，磷酸盐缓冲液混合，温浴后加入磷酸盐缓冲液，3-甲基-2-苯并噻 唑啉酮腙盐酸盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，铂铋纳米模拟过氧化 物酶水溶液，温浴后目视观察或测定紫外可见吸收;所述的铂铋纳米模拟过氧化物酶由以 下步骤制得的：在5 mL浓度为50 mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5 mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 °C反应2 h， 反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清 白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米 铂粉末，在0.6 mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋白-铂水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝酸铋溶液和1.8 mL浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 °C 反应2.5 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次， 得到铂铋纳米模拟过氧化物酶的水溶液，将铂铋纳米模拟过氧化物酶水溶液冷冻干燥得到 铂铋纳米模拟过氧化物酶粉末。
[0006] 所述的基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测方法，其特征是将80 yL浓度 为180 U/mL的葡萄糖氧化酶与640 yL不同浓度的葡萄糖标准溶液，80 yL浓度为10 mmol/ L，pH=7的磷酸盐缓冲液混合，37°C温浴30 min，加入1.3 mL浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸 盐缓冲液，1 mL浓度为0.5 mmol/L的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，800 yL浓度为3 mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，100 yL浓度为4.76 mg/mL铂铋 纳米模拟过氧化物酶水溶液，37°C温浴30 min，目视观察溶液颜色或测定紫外可见吸收。
[0007] 所述的基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测方法，其特征是显色产物溶液 颜色为紫色，随着葡萄糖浓度的增大，溶液颜色加深，目视观察溶液颜色的检测限为5 μ mol/L〇
[0008] 所述的基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测方法，其特征是显色产物最大 吸收波长为590 nm，根据590 nm波长处测得的吸光度作标准曲线，其检测的线性范围为1~ 100 ymol/L，检测限为0.2 ymol/L。
[0009] 本发明实现葡萄糖检测试剂盒的目的，本发明采用以下技术方案： 本发明所述的一种基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测试剂盒，其特征是试剂 盒中包括a液、b液、标准液、酶液和样品稀释液，所述a液中含有3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙 盐酸盐和N-乙基-N_(2-羟基-3-磺丙基)-3_甲基苯胺钠盐，b液中含有铂铋纳米模拟过氧 化物酶溶液，标准液为葡萄糖标准溶液，酶液为葡萄糖氧化酶溶液。
[0010] 上述a液中含有浓度为0.28 mmol/L的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和浓度 为1.33 mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐;b液中含有用10 mmol/ L，pH=7的磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.34 mg/mL的铂铋纳米模拟过氧化物酶溶液;标准液 包括浓度为6.25，31.25，62.5，125，250，375，500，625 ymol/L的葡萄糖溶液;酶液包括用10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液配制的浓度为90 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液;样品稀释液包括 10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液。
[0011]所述的钼祕纳米模拟过氧化物酶由以下步骤制得的：在5 mL浓度为50 mg/mL的牛 血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5 mol/L 氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 °C反应2 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水 溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末，在0.6 mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋 白-铂水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝酸铋溶液和1.8 mL浓度为10 mmol/L，pH =7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 °C反应2.5 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤 管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到铂铋纳米模拟过氧化物酶的水溶液，将铂铋纳米 模拟过氧化物酶水溶液冷冻干燥得到铂铋纳米模拟过氧化物酶粉末。
[0012] 本发明所述的一种基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测试剂盒的应用，其 特征是作为葡萄糖检测。
[0013] 所述的一种基于铂铋纳米模拟过氧化物酶的葡萄糖检测试剂盒的应用，其特征是 在640 yL标准液中加入160 yL酶液，37°C温浴30 min，加入1.8 mL a液和1.4 mL b液，37°C 温浴30 min，测定590 nm处的吸光度，绘制葡萄糖标准曲线或计算回归方程;在40 yL人血 清样品中加入600 yL样品稀释液，160 yL酶液，37°C温浴30 min，加入1.8 mL a液和1.4 mL b液，37°C温浴30 min，测定590 nm处的吸光度，根据标准曲线或回归方程，计算血清样品 中葡萄糖的含量。
[0014]本发明的检测方法采用如下的具体技术方案： (一)在5 mL浓度为50 mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯 铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5 mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 °C反应2 h。反应后溶 液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳 米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末。在 0.6 mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋白-钼水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝 酸铋溶液和1.8 mL浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 °C反应2.5 h， 反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到铂铋纳 米模拟过氧化物酶水溶液。将铂铋纳米模拟过氧化物酶水溶液冷冻干燥得到铂铋纳米模拟 过氧化物酶粉末。制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗， 晾干。
[0015](二)本发明的葡萄糖检测方法:将80 yL浓度为180 U/mL的葡萄糖氧化酶，640 yL 不同浓度的葡萄糖标准溶液，80 μL^度为10 mmo 1 /L，pH=7的磷酸盐缓冲液混合，37°C温浴 30 min后，加入1.3 mL浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，1 mL浓度为0.5 mmol/L的 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，800 μL^度为3 mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙 基)-3-甲基苯胺钠盐，100 yL