一种雌酮分子印迹电化学传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种环境检测和分析化学技术领域，尤其涉及一种分子印迹电化学传 感器的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，雌激素如雌酮，17β-雌二醇，雌三醇，17α-乙炔基雌二醇等作为典型的内 分泌干扰物引起人们广泛关注。雌激素对人类和其他生物体可能造成严重危害主要通过饮 用水或者食物链的富集作用。这类污染物类似雌激素对生物体产生作用，即使浓度为痕量 都能严重影响生物体内分泌系统失衡，进而危害并威胁到人类和其他生物体的健康生存和 持续繁衍。
[0003] 环境水体中雌激素绝大部分来源于污水厂废水排放和污泥的填埋或者是用作土 壤肥料，通过降水、地表径流等进入水体造成水环境污染。通常这类来源的天然雌激素浓度 一般在ng/L~ug/L范围内。其他潜在的天然雌激素来源是发达的农场集水区，例如在线废水 处理系统故障、施肥过程中肥料的流失或者是牲畜废水的流出等意外污染，由于这些基质 复杂，需要在前处理的基础上完成，目前，雌酮检测技术主要有色谱质谱联用法和放射免疫 法。例如，食品安全国家标准奶及奶制品中雌二醇，雌三醇，炔雌醇多残留的测定，气相色 谱-质谱法一一GB 29698-2013;牛奶和奶粉中β-雌二醇残留量的测定，气相色谱-负化学电 离质谱--GB/T 22967-2008;饲料中雌二醇的测定，液相色谱-串联质谱法，农业部2224号 公告-3-2015;出口肉及肉制品中雌二醇残留量检验方法，放射免疫法--SN0664-1997等。 上述检测方法中，色谱质谱方法的检测可靠性高，但存在仪器昂贵、普及性不高、前处理步 骤繁琐、不适用于现场检测等不足。
[0004] 由于内分泌干扰物的结构相似性，色谱质谱方法检测需在样品前处理基础上，进 一步利用高效色谱分离检测技术实现定量分析和质谱定性分析的联用。分子印迹技术是利 用化学方法模拟生物体系中抗原-抗体的特异选择特性识别分子技术，能够有效实现相似 结构化合物的识别。分子印迹技术和电化学传感器的结合使用，不仅具有分子印迹聚合物 高灵敏度高选择性的优点，同时也具有电化学传感器自身便于自动化和现场检测使用，检 测成本低。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是基于溶胶凝胶法制备分子印迹聚合物，构建一种简单、快速、 灵敏的分子印迹电化学传感器及其制备方法。
[0006] 本发明的目的之二是通过分子印迹电化学传感器应用于雌酮的快速、高效、灵敏 的检测目的。
[0007] 本发明的技术方案如下:本发明所述的一种雌酮分子印迹电化学传感器的制备方 法，包括如下步骤： (1)在离心管中分别加入四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙 醇、浓度为0.05~0.2mol/L的盐酸和超纯水组成溶胶混合液，所述的四乙氧基硅烷、甲基甲 氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、浓度为0.05~0.2mol/L的HC1、超纯水的体积比为： 20:6:4: 20:1:20~20:6:8: 20:1:20，混悬后得到均一、透明的溶胶-凝胶，所得到的溶胶-凝 胶即为非分子印迹聚合物； (2) 在上述非分子印迹聚合物中加入50~150 mg/L的雌酮溶液，混悬后形成分子印迹 聚合物，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比为5:1~15:1，在干燥条件下室温存 放； (3) 称取多壁碳纳米管(MWCNT)加入浓硫酸和浓硝酸的混合液中，所述多壁碳纳米管 与浓硫酸和浓硝酸的混合液的比例为8 mg/12 mL~15mg/12mL，所述浓硫酸与浓硝酸的体积 比为2:1~5:1，所述浓硫酸的浓度为16.0~18.4 mo 1 /L，所述浓硝酸的浓度为14~16 mo 1 /L; 在70~100 °C加热回流后，用纯水反复洗至中性，用纤维滤纸抽滤，40~60 °C真空干燥箱烘 干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯下研磨成端基羧酸化的MWCNT粉状储存； (4) 称取步骤(3)端基羧酸化的MWCNT粉状加入二甲亚砜，超声分散后得到均一、稳定 的悬浊液;取所述的悬浊液滴涂于金电极表面，室温晾干即得MWCNT修饰的金电极； (5) 在步骤(4)获得的MWCNT修饰的金电极表面滴涂步骤(2)制得的分子印迹聚合物， 室温晾干;将晾干后的电极置于40~50 °C超纯水中磁力搅拌洗脱以去除模板分子雌酮，得 到雌酮分子印迹电化学传感器。
[0008] 在上述步骤（1)中所述的HC1浓度优选O.lmol/L ;所述四乙氧基硅烷、甲基甲氧基 硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、0.1 M HC1和超纯水的体积比优选为20:6:6:20:1:20。
[0009] 在上述步骤（1)中所加入的四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无 水乙醇、HC1和超纯水组成溶胶混合液，通过混悬1 h，得到均一、透明的溶胶-凝胶。
[0010] 在上述步骤(2)中，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比优选10:1，所述 雌酮溶液的浓度优选100 mg/L。
[0011] 在上述步骤(2)中，在非分子印迹聚合物中加入雌酮溶液混悬1 h后形成分子印迹 聚合物。
[0012] 在上述步骤(3)中，称取多壁碳纳米管(MWCNT)IO mg加入到浓硫酸和浓硝酸的12 mL混合液中，所述浓硫酸和浓硝酸体积比=3:1，持续4 h的90 °C加热回流，纯水反复洗至 中性，用0.25 μπι的纤维滤纸抽滤，40 °C真空干燥箱烘干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯 下研磨成粉状储存。
[0013] 在上述步骤(4)中，称取1.0 mg端基羧酸化的丽CNT粉状加入1 mL二甲亚砜，超声 分散20 min，得到均一、稳定的悬浊液;取2.5 yL悬浊液滴涂于金电极表面，室温晾干即得 MWCNT修饰的金电极。
[0014] 在上述步骤(5)中，在MWCNT修饰的金电极表面滴涂10 yL的分子印迹聚合物，室温 晾干;将晾干后的电极置于40 °C超纯水中磁力搅拌洗脱1 h，去除模板分子雌酮，得到雌酮 分子印迹电化学传感器。
[0015] 本发明所述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学传感器，应用于雌酮环境内分 泌干扰物的检测，其特征在于，包括如下步骤： (1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，使用上述的制备方法制得的雌酮分 子印迹电化学传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，在3 mL、pH 6.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液配制的1 mg/L雌酮溶液中检测分析； (2) 采用循环伏安法在-1.2~2.0 V电压范围内扫描，扫描速率为0.1 V/s，检测得到雌 酮对雌酮分子印迹电化学传感器具有电催化还原作用； (3) 与步骤(2)在相同条件下将雌酮分子印迹电化学传感器用于检测与雌酮结构相近 的雌二醇、双酸A以及壬基酚的溶液，确定雌酮分子印迹电化学传感器对雌酮具有特异选择 功能； (4) 由步骤(2)得到的雌酮对雌酮分子印迹电化学传感器具有电催化还原作用，根据所 得电流强度与雌酮标准溶液浓度之间的线性关系，建立雌酮定量曲线； (5) 将待测水样代替雌酮的标准溶液，待测水样经0.25 μπι过滤，按照步骤(4)雌酮定量 曲线的方法进行检测分析； (6) 将雌酮分子印迹聚合物分别在室温下放置5天、10天、30天之后再按照上述的制备 方法制备雌酮分子印迹电化学传感器，按照步骤(4)雌酮定量曲线的方法进行检测分析。
[0016] 本发明所述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学传感器，其特征在于，所述的 雌酮分子印迹电化学传感器能够特异性识别溶液中雌酮，并且实现对水体中的雌酮分子进 行现场及时快速定量检测分析。
[0017] 具体地说，本发明所述的一种雌酮分子印迹电化学传感器的制备方法，其制备方 法的步骤是： (1)在离心管中分别加入四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙 醇、HC1 (0. lmol/L )和超纯水(体积比为:20:6:6:20:1:20)组成溶胶混合液，混悬1 h，得到 均一、透明的溶胶-凝胶，得到的溶胶-凝胶即为