用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学dna传感器及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种用于检测汞离子或半胱氨酸的电 化学DNA传感器及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 汞作为重金属污染物之一，具有高毒性并对人体健康和生态系统有着严重危害 性。汞在环境中的存在形式有很多种，其中汞离子(Hg 2+)作为一种最常见和最稳定的存在形 式，广泛地分布在各类水体中。世界健康组织(WHO)曾规定饮用水中汞离子总含量不能超过 0.001mg/L。由此可见，发明一种绿色环保、成本低廉且可以快速灵敏地检测水体中的汞离 子浓度的传感器是极其必要的。
[0003] 半胱氨酸(Cys)是一种含硫的自然氨基酸，在生物有机体内扮演着重要的角色，其 与生物体内蛋白质的合成有着密不可分的联系。近些年来，Cys被发现可作为一种潜在的神 经毒素标志物，以及各种疑难杂症如心脏病和AIDS的生理调节剂。因此对生物样品内的Cys 进行定量检测也显得极其重要。
[0004] 目前，关于检测汞离子和Cys的方法有很多，其中传统的检测技术包括原子吸收/ 发射光谱法（AAS/AES)、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS)、冷蒸汽原子荧光光谱法 (CVAFS)、高效液相色谱法(HPLC)以及毛细管电泳法等，这些方法虽然有较高的精确度和灵 敏性，但往往样品制备复杂且耗时长，要求专业的操作人员且机器笨重、成本高。近些年来， 伏安法、荧光法等一系列新的方法被研究用来检测汞离子和Cys，而电化学方法由于其独特 的优势如方便携带、灵敏度高等已被广泛研究并应用于检测重金属离子或有机物分子。 [0005]现今，随着电化学技术及生物传感技术的日益成熟，各式各样的电化学生物传感 器已经被研发并用于检测各种目标物质，其中电化学DNA传感器便是目前研究比较广泛的 一种传感器之一。这些传感器中的大部分有着良好的线性范围和低的检测极限，然而它们 中大多数只针对一种目标对象，不能用来检测多种物质。为了提高传感器的利用效率，发明 一种可以检测多种目标物质的传感器也是极其必要的。此外，在构建电化学生物传感器的 过程中，工作电极作为其中重要的一部分，如何提高它的稳定性和电子传导能力也是研究 的热点和重点。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够检测两种目标物 质、稳定性高、使用寿命长、抗干扰能力强、检测范围宽、检测极限低的用于检测汞离子或半 胱氨酸的电化学DNA传感器，并相应提供一种简单安全，成本低，制作快速的电化学DNA传感 器的制备方法，在此基础上，还提供一种上述电化学DNA传感器的应用，该应用能够以低的 检测极限及较强的抗干扰性分别实现对汞离子和半胱氨酸的检测。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种电化学DNA传感器，包括在三电极体系中用作工作电极的玻碳电极，所述玻碳 电极反应端表面修饰有包括自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒子的组成的复 合膜，所述复合膜表面自组装有DNA捕获探针，所述DNA捕获探针的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1的DNA序列。进一步优选的，所述自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒子从 内至外依次排列于所述玻碳电极反应端表面形成复合膜。进一步优选的，所述DNA捕获探针 可通过T-Hg 2+-T结构错配形成发夹结构。
[0009] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的电化学DNA传感器的制备方 法，包括以下步骤：
[0010] S1、修饰自掺杂聚苯胺纳米纤维:在玻碳电极反应端表面滴加自掺杂聚苯胺纳米 纤维悬浮液，得到自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极；
[0011] S2、修饰有序介孔碳:在所述步骤S1得到的自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电 极反应端表面滴加有序介孔碳悬浮液，得到有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻 碳电极；
[0012] S3、电沉积金纳米粒子:在所述步骤S2得到的有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维 修饰的玻碳电极反应端表面电沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯 胺纳米纤维修饰的玻碳电极；
[0013] S4、自组装DNA捕获探针:在所述步骤S3得到的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚 苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加 DNA捕获探针进行反应，使所述DNA捕获探针 通过金硫共价键固定在所述玻碳电极反应端表面，完成所述电化学DNA传感器的制备。
[0014] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S1中的自掺杂聚苯胺纳米纤维采用一步化学 氧化法合成。进一步优选的，所述化学氧化法的具体步骤为：将溴化十六烷基三甲铵 (CTAB)，苯胺(AN)，2_氨基苯磺酸(ABS)溶解于盐酸溶液中，然后加入过硫酸铵(APS)溶液， 在5°C下反应24h得到自掺杂聚苯胺纳米纤维。进一步优选的，所述CTAB、AN、ABS的质量比为 0.22:0.46:0.86。所述过硫酸铵的浓度为0.06M。
[0015] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S2中的所述有序介孔碳采用以下方法制备得 到：
[0016] S2-1.合成硅基分子筛SBA-15:将嵌段共聚物P123和正硅酸乙酯混合后在140°C~ 150 °C下水浴，然后焙烧得到硅基分子筛SBA-15;
[0017] S2-2.合成有序介孔碳:所述硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸混合得到混合 物，将所述混合物置于100°c~160 °C温度下干燥直至混合物变为黑色，然后将黑色的混合 物置于惰性气体保护下进行高温热解得到热解产物，将所述热解产物经过洗涤、干燥等步 骤得到所述有序介孔碳。
[0018]上述的制备方法，优选的，所述步骤S3中，采用计时电流法将所述金纳米离子沉积 在所述有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面，所述计时电流法 的沉积电位为〇. 2V，沉积时间为60s~150s。
[0019]上述的制备方法，优选的，所述步骤S4具体为：在所述步骤S3得到的金纳米粒子/ 有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加 DNA捕获探针，在4°C 下反应12h;然后转入6-巯基乙醇(MCH)溶液中培养0.5h~1 h，完成所述电化学DNA传感器的 制备。进一步优选的，所述DNA捕获探针的浓度为ΙμΜ~5μΜ。所述6-巯基乙醇的浓度为ImM。
[0020] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的电化学DNA传感器或采用所 述制备方法制得的电化学DNA传感器在检测汞离子中的应用。
[0021] 上述的应用，优选的，所述检测汞离子的应用方法包括以下步骤：
[0022] (1)将所述电化学DNA传感器的玻碳电极反应端浸泡在含汞离子的待测溶液中反 应，使所述电化学传感器上的DNA捕获探针与待测溶液中的汞离子形成T-Hg 2+_T错配；
[0023] (2)将所述电化学DNA传感器转入含信号指示剂AQDS的溶液中，使所述AQDS插入 DNA双链中；
[0024] (3)以经过所述步骤(2)处理过后的玻碳电极作为工作电极，置于含NaCl的PBS缓 冲液中，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法测 试;根据汞离子浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待 测溶液中的汞离子浓度。
[0025] 上述的应用，优选的，所述步骤(1)中，所述反应时间为lh~2h。
[0026] 上述的应用，优选的，所述步骤(2)中，所述反应时间为6h~8h。
[0027] 上述的应用，优选的，所述步骤(3)中，所述缓冲溶液是在0.05M 1?缓冲溶液中加 入NaCl得到的roS缓冲溶液，缓冲溶液中含0.2M~0.5M NaCl，缓冲溶液的PH值为7.0。进一 步优选的，缓冲溶液中含0.3M NaCl。
[0028] 上述的应用，优选的，所述汞离子浓度与峰电流变化关系的检测线性回归方程为：
[0029] yi = -9.147x1+164.597 (1)
[0030] 式中，yi表示峰电流与背景峰电流的差值，即ΔΙρ，单位为μΑ;Χ1为待测溶液中汞离 子浓度负对数值，即-l〇g[Hg 2+]，汞离子浓度的单位为Μ;式⑴的相关系数R2 = 0.9934,萊离 子