度进行检查
[0098]为了进一步验证实施例1的电化学DNA传感器在实际应用中的检测效果，现采用标 准添加法，将该电化学DNA传感器用于实际样品中的目标物检测(测定方法参照实施例3和 实施例4)，进行回收率实验。
[0099]具体的实验步骤:将湘江水和自来水分别经过滤等预处理后，用Tris-HCl缓冲溶 液调节pH至7.0;另外，将人体尿样稀释，用乙腈沉淀预处理去除其中可能存在的半胱氨酸， 将其分成两份并分别调节pH至7.0。在上述样品中标准添加已知浓度的目标物质，各样品中 目标物质的标准添加浓度参照表1，最后将实施例1的电化学DNA传感器分别按照实施例3和 实施例4的方法检测待测溶液中的Hg 2+和半胱氨酸浓度，测定结果列于表1中。
[0100]表1:待测溶液的回收率验证结果
[0101]
L0103」从表1中可以看出，本发明的电化学DNA传感器在可测定的浓度范围内，测定结果 理想，相比传统的检测技术，本发明的检测方法操作简单快速。
[0104]实施例6:对电化学DNA传感器的选择性进行检查
[0105]为了进一步验证实施例1的电化学DNA传感器具有较好的抗干扰能力，现用实施例 1 中的传感器分别对含有浓度均为 1. 〇 X 1 〇-6M的K+、Pb2+、Cd2+、Cu2+、Zn 2+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Cr3 +、A13+溶液和含浓度均为1.0 X 1(T7M的丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸 (116)、脯氨酸(？仰）、苯丙氨酸(？116)、色氨酸(1'^)、蛋氨酸(16〇、甘氨酸(61 7)、酪氨酸 (Tyr)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸 (Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)及谷氨酸(Glu)进行测试(测定方法参照实施例3和实 施例4)，测试结果如附图8和附图9所示，由此可见实施例1中的电化学DNA传感器除了对Hg 2+ 和Cys有较好的响应外，对其它重金属离子或氨基酸均有较好的抗干扰能力。
[0106]以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实 施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，包括在三电极体系中用作工 作电极的玻碳电极，其特征在于，所述玻碳电极反应端表面修饰有包括自掺杂聚苯胺纳米 纤维、有序介孔碳和金纳米粒的组成的复合膜，所述复合膜表面自组装有DNA捕获探针，所 述DNA捕获探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.1的DNA序列。2. -种如权利要求1所述的电化学DNA传感器的制备方法，包括以下步骤： 51、 修饰自掺杂聚苯胺纳米纤维:在玻碳电极反应端表面滴加自掺杂聚苯胺纳米纤维 悬浮液，得到自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极； 52、 修饰有序介孔碳:在所述步骤S1得到的自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反 应端表面滴加有序介孔碳悬浮液，得到有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电 极； 53、 电沉积金纳米粒子:在所述步骤S2得到的有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰 的玻碳电极反应端表面电沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳 米纤维修饰的玻碳电极； 54、 自组装DNA捕获探针:在所述步骤S3得到的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺 纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加 DNA捕获探针进行反应，使所述DNA捕获探针通过 金硫共价键固定在所述玻碳电极反应端表面，完成所述电化学DNA传感器的制备。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用计时电流法将所 述金纳米离子沉积在所述有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表 面，所述计时电流法的沉积电位为〇. 2V，沉积时间为60s~150s。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4具体为:在所述步骤S3得 到的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加 DNA 捕获探针，在4°C下反应12h;然后转入6-巯基乙醇溶液中培养0.5h~lh，完成所述电化学 DNA传感器的制备。5. -种权利要求1所述的电化学DNA传感器或采用权利要求2至4任一项所述制备方法 制得的电化学DNA传感器在检测汞离子中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测汞离子的应用方法包括以下步 骤： (1) 将所述电化学DNA传感器的玻碳电极反应端浸泡在含汞离子的待测溶液中反应，使 所述电化学传感器上的DNA捕获探针与待测溶液中的汞离子形成T-Hg 2+-T错配； (2) 将所述电化学DNA传感器转入含信号指示剂AQDS的溶液中，使所述AQDS插入DNA双 链中； (3) 以经过所述步骤(2)处理过后的玻碳电极作为工作电极，置于含NaCl的PBS缓冲液 中，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法测试； 根据汞离子浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶 液中的汞离子浓度。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述汞离子浓度与峰电流变化关系的检测 线性回归方程为： yi = -9.147x1+164.597 (1) 式中，yi表示峰电流与背景峰电流的差值，即△ Ip，单位为μΑ;Χ1*待测溶液中汞离子浓 度负对数值，即_l〇g[Hg2+]，汞离子浓度的单位为Μ;式（1)的相关系数R2 = 0.9934,汞离子检 测线性范围为1 X 10-6Μ~1 X 10-14Μ，检测下限为6.152 X 10-16Μ。8. -种权利要求1所述的电化学DNA传感器或采用权利要求2至4任一项所述制备方法 制得的电化学DNA传感器在检测半胱氨酸中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测半胱氨酸的应用方法包括以下步 骤： (1) 将所述电化学DNA传感器的玻碳电极反应端浸泡在含汞离子的溶液中反应，使所述 电化学传感器上的DNA捕获探针与溶液中的汞离子形成T-Hg 2+-T错配； (2) 将所述电化学DNA传感器转入含信号指示剂AQDS的溶液中，使所述AQDS插入DNA双 链中； (3) 将所述电化学DNA传感器转入含半胱氨酸的待测溶液中； (4) 以经过所述步骤(3)处理后的玻碳电极作为工作电极，置于含NaCl的PBS缓冲液中， 建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法测试;根据 半胱氨酸浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液 中的半胱氨酸浓度。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，当所述汞离子浓度为ΙΟΟηΜ时，所述半胱 氨酸浓度与峰电流变化关系的检测线性回归方程为： y2 = 10.017x2-36.047 (2) 式中，y2表示峰电流，即Ip，单位为μΑ;Χ2为溶液中半胱氨酸浓度负对数值，即-log [Cys]，半胱氨酸浓度的单位为Μ;式(2)的相关系数R2 = 0.9895,半胱氨酸检测线性范围为1 X 10-7M~1 X 10-nM，检测下限为 1 X 10-13M。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器及其制备方法和应用，其中电化学DNA传感器包括在三电极体系中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极反应端表面修饰有包括自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒的组成的复合膜，复合膜表面自组装有DNA捕获探针，DNA捕获探针的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1的DNA序列。其制备方法，包括修饰自掺杂聚苯胺纳米纤维和有序介孔碳、电沉积金纳米粒子、组装DNA捕获探针等步骤。本发明的用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，能够检测两种目标物质、稳定性高、使用寿命长、抗干扰能力强、检测范围宽、检测极限低，可用于检测汞离子或半胱氨酸。
【IPC分类】G01N27/26
【公开号】CN105675676
【申请号】CN201610044981
【发明人】汤琳, 谢霞, 周耀渝, 曾光明, 彭博, 龙蓓青, 邓垚成
【申请人】湖南大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月22日