分析样品中的蛋白质或肽的方法
【专利说明】分析样品中的蛋白质或肽的方法
[0001]本申请是申请日为2010年4月29日的发明名称为“使用潮湿的多孔材料产生离子”的中国专利申请第201080019239.3号的分案申请。
技术领域
[0002]本发明大体上涉及用于对样品进行质谱分析的系统和方法。
【背景技术】
[0003]质谱分析法是一种用于分析化学(尤其是生命科学)的重要研究和应用的非常灵敏的分析法。电喷雾电离(ESI)通常被视作是用于电离溶液相分子的最具特点且最有效的方法。该方法可以简单地分成三个阶段:液滴形成、液滴蒸发和离子形成(加斯克尔.S.J，质谱学报 1997(Gaskell，S.J.Journal of Mass Spectrometry 1997)，32，677_688)。当向流过质谱仪探针的溶液施加强电场时，探针的针尖处会形成泰勒圆锥，从而使小液滴形成的薄雾从此圆锥的尖端喷出。由于游离液滴蒸发和库仑力的存在，因此产生样品分析物的离子。所述离子进入质谱仪，随后进行分析。
[0004]ESI存在的问题是，要使用ESI对许多类型的样品进行分析，必须先制备样品。在使用ESI质谱分析法分析样品之前，要对样品进行提取和过滤规程，以提纯所述样品，例如，清除盐和清洁剂。这些规程复杂、耗时且昂贵。此外，提纯过程中使用的试剂可能会干扰随后对所提纯的样品中的目标分析物进行分析。此外，非溶液态的样品在进行ESI分析之前必须溶解和提纯。
[0005]近来，已形成常压电离的概念，现在常压电离一族的成员超过二十个，例如，解吸电喷雾电离(DESI)和实时直接分析(DART)。使用质谱分析法进行常压电离可以在不进行过多或甚至不进行任何样品制备和/或预先制备的情况下在常压环境下从凝相样品中电离分析物，从而提供用于对复杂混合物和生物样品进行实时实地分析的溶液。这些常压电离方法引领并延续着质谱分析法在生命科学、环境监测、法医应用和治疗分析方面的革命。然而，上文所述的常压电离技术在分析样品时仍然需要气动辅助、持续的溶剂流和高压电源。
[0006]需要可以将样品制备和预处理与对样品进行质谱分析的电离过程相结合使得在分析样品时不需要气动辅助或持续的溶剂流的系统和方法。
【发明内容】
[0007]本发明大体上涉及由流体和固体样品产生离子用于质谱分析的新系统和方法。多孔材料(例如，滤纸)或类似材料可容纳并转移液体；当向这些材料施加高电压时，所述材料的边缘会直接产生离子。所述多孔材料保持与溶剂流分离(即，独立或分开的)。事实上，会将样品点到多孔材料上，或者将多孔材料润湿，然后用多孔材料擦拭含该样品的表面。接着，点到或擦到样品的多孔材料会被润湿并连接到高压电源以产生样品的离子，随后对这些离子进行分析。样品可通过多孔材料输送，而不需要单独的溶剂流。
[0008]本发明的装置和方法将样品制备和预处理与对样品进行质谱分析所需的电离过程相结合。本发明的装置和方法可以对基体复杂的原生物样品(例如，生物流体和组织)中的化学物质进行快速直接分析，而无需制备样品。在特定实施例中，本发明的装置和方法可以对干的血点或尿斑进行分析。
[0009]本发明的一方面提供一种包括连接到高压电源的多孔材料的质谱探针，其中所述多孔材料与溶剂流分离。示例性多孔材料包括纸，例如，滤纸，或PVDF膜。多孔材料可具有任何形状。在某些实施例中，多孔材料可为三角形。
[0010]在某些实施例中，探针进一步包括施加到多孔材料的个别量的溶剂，例如，一滴或多滴液滴。溶剂可为一滴或多滴液滴，而且其量要足够润湿多孔材料。只要向多孔材料施加溶剂，溶剂便可辅助样品通过多孔材料进行输送。溶剂可能含有内标物。溶剂/基材化合物可以区别保留化学性质不同的样品成分。在某些实施例中，溶剂可使盐和基体的效应最小化。在其他实施例中，溶剂包括可对所选的分析物进行在线化学衍生的化学试剂。
[0011 ]本发明的另一方面提供一种用于分析样品材料的系统，其包括:探针，所述探针包括连接到高压电源的多孔材料，其中所述多孔材料保持与溶剂流分开；以及质谱分析仪。所述质谱分析仪可为台式质谱仪或手持式质谱仪类型。示例性质谱分析仪包括四极离子阱质谱仪、直线离子阱质谱仪、圆柱形离子阱质谱仪、离子阱回旋共振质谱仪和轨道阱质谱仪。
[0012]本发明的又一方面包括一种用于分析样品的方法，其包括:将样品与多孔材料接触，其中所述多孔材料与溶剂流分开;将高电压施加到多孔材料以产生样品中分析物的离子，所述离子从多孔材料中排出；以及分析所排出的离子。所述方法可进一步包括向多孔材料施加个别量的溶剂，例如，一滴或多滴液滴。在某些实施例中，所述分析涉及提供质谱分析仪以产生样品中分析物的质谱。
[0013]在某些实施例中，样品为液体。在其他实施例中，样品为固体。在样品为固体的实施例中，可使用多孔材料擦拭样品表面。可在擦拭了固体样品之前或之后将溶剂施加到多孔材料上。示例性样品包括化学物质或生物物质。
[0014]本发明的又一方面提供一种电离样品的方法，其包括向多孔材料施加高电压以产生样品中分析物的离子，其中所述多孔材料与溶剂流保持分开。示例性多孔材料包括纸或PVDF 膜。
【附图说明】
[0015]图1A为将样品溶液供给一张纸进行电喷雾电离的图。图1B为将样品溶液预先点到这张纸上随后将一滴溶剂供给这张纸进行电喷雾电离的图。
[0016]图2A为使用本发明探针得到的海洛因(浓度:Ippm，量:10μ I，溶剂:Me0H/H20/H0Ac(50:49:1,v/v/v))的MS谱。图2B为海洛因(浓度:1ppb，量:IΟμ?，溶剂:Me0H/H20/H0Ac(50:49:l，v/v/v))的 MS/MS 谱。
[0017]图3A为使用本发明探针得到的咖啡因(浓度:10ppm，量:10μ1，溶剂:Me0H/H20/HOAc (50:49:1, v/v/v))的 MS 谱。图 3B 为咖啡因(浓度:1ppb，量:1 Ομ?,溶剂:Me0H/H20/H0Ac(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
[0018]图4A为使用本发明探针得到的苯甲酰芽子碱(浓度:IOppm，量:I Ομ?，溶剂:MeOH/H20/H0Ac(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图4B为苯甲酰芽子碱(浓度:1ppb，量:10μ1，溶剂:Me0H/H20/H0Ac(50:49:1 ,v/v/v))的MS/MS谱。
[0019]图5A为使用本发明探针得到的丝氨酸(浓度:Ippm，量:10μ1，溶剂:Me0H/H20/H0Ac(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图5B为丝氨酸(浓度:10ppb，量:10μ1，溶剂:Me0H/H20/H0Ac(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
[0020]图6A为使用本发明探针得到的肽类缓激肽2-9(浓度:1ppm，量:IΟμI，溶剂:MeOH/H20/H0Ac(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图6B为肽类缓激肽2-9(浓度:Ippm，量:ΙΟμΙ，溶剂:Me0H/H20/H0Ac(50:49:1 ,v/v/v))的MS/MS谱。
[0021]图7A的MS/MS谱显示可使用“点”方法从全血样品中检测出海洛因。图7B显示没有海洛因的血点的MS/MS谱。
[0022]图8A的MS/MS谱显示可使用“点”方法从原尿样品中检测出海洛因。图SB显示没有海洛因的尿点的MS/MS谱。
[0023]图9A的MS谱显示在未进行样品制备的情况下从可乐中检测出咖啡因。图9B的MS谱显示从咖啡粉中检测出咖啡因。可用纸片擦拭咖啡袋的表面来收集咖啡粉。
[0024]图10显示在未进行样品制备情况下执行的尿分析的MS谱。图1OA的MS谱显示从喝咖啡的人尿中检测出咖啡因。图1OB的MS谱显示从未喝咖啡的人尿中未检测出咖啡因。
[0025]图11的MS谱显示使用相同参数(?2kV，溶剂:MeOH: H2O = 1:1)对(A)纸三角与(B)PVDF膜进行肽分析(1ppm缓激肽2-9)所产生的差异。
[0026]图12显示使用四种植物的切片组织直接得到的植物组织MS谱。(A)洋葱，(B)大葱以及两种不同的叶子(C)和(D)。
[0027]图13显示维生素C的MS/MS谱。图13A是在未制备样品的情况下对洋葱的直接分析。图13B使用了标准溶液。
[0028]图14A的图显示对纸上干血点的分析;将0.4yL全血直接施加到层析纸的三角形区(通常为高10mm，底长5_)。用铜夹将纸片固持在LTQ质谱仪(美国中部圣何塞赛默飞世尔科技，(Thermo Fisher Scientific, San Jose ,CA))入口的前端，然后将直流电压(4.5kV)施加到用1yL甲醇/水(1: lv/v)润湿的纸上。
[0029 ]图14B图示伊马替尼(格列卫)的分子结构和0.4yL含有4yg/mL伊马替尼的全血的纸喷雾串联质谱。伊马替尼由MS/MS转变m/z 494Dm/z 394(插图)来表示和量化(插图)。图14C图示掺入了伊马替尼(62.5-44yg/mL)及其同位素伊马替尼-d8(lyg/mL)的全血的定量分析。插图曲线表示低浓度范围。
[0030]图15为血管紧张素I溶液的纸喷雾器质谱。插图表示质量范围为630-700的展开图。
[0031]图16的质谱显示用本发明探针对动物组织中的激素进行的直接分析。
[0032]图17A和图17B的质谱显示对人类前列腺肿瘤组织和正常组织进行的直接分析。
[0033]图18为掺入了lOyg/mL阿替洛尔的全血的质谱。所得数据是通过将本发明的系统和方法与手持式质谱仪相结合获得的。
[0034]图19A到图19F显示从六种不同类型的纸(微孔大小不同的沃特曼滤纸:(a)3ym，(b)4-7ym，(c)8ym，及(d)llym，(e)玻璃纤维纸和(f)层析纸)中喷射出来的可卡因的质谱。喷雾电压为4.5kV。
[0035]图20A所示为表现纸喷雾器的空间分布特征的示意性装置。图20B是一个2D轮廓图，显示探针在相对于质谱仪入口在x-y平面中移动时m/z 304的相对强度。图20C的图显示在纸上注入不同浓度或量的可卡因溶液、或用聚四氟乙烯膜密封所述纸时m/z 304的信号持续时间。
[0036]图21为一组纯化学溶液的MS谱及其相应的MS/MS谱。所述谱分别为(A)丝氨酸、(B)美沙酮、(C)罗红霉素和(D)缓激肽2-9的谱。
[0037]图22这组质谱显示对复杂混合物中的化学物质进行的分析和在未进行样品制备的情况下从表面得来的直接分析情况。图22A和图22B为在(A)正模式和(B)负模式下直接在纸上分析得到的可口可乐(可乐)的质谱。图22C为咖啡因的质谱。图22D为苯甲酸钾的质谱。图22E为乙酰磺胺酸钾的质谱。图22F为从尿中检测出的咖啡因的质谱。图22G为在擦拭桌面之后用本发明探针直接从桌面检测出的海洛因的质谱。
[0038]图23A显示用于血液分析的本发明探针的图像。在此实施例中，多孔材料为纸。左边的图显示点上全血之前的情况。中间的图显示点上全血之后让血点变干的情况。右边的图显示将甲醇添加到纸之后让其在纸上行进的情况。右边的图显示甲醇与血点相互作用从而让分析物行进到纸尖以用于电离和分析的情况。图23B为全血中的阿替洛尔的质谱。图23C为全血中的海洛因的质谱。
[0039]图24图示分析由TLC分开的两种染料亚甲蓝(m/z284)和甲基紫(m/z358.5)。将染料混合物溶液(0.Ιμ?的lmg/mL溶液)施加到层析纸(4cm x0.5cm)上并在进行TLC和纸喷雾MS分析之前弄干。
[0040]图25显示本发明探针的不同形状、厚度和角度。图25A显示锐度。图25B显示针尖的角度。图25C显示纸的厚度。图2?显示有多个喷头的装置。图25E显示具有用锋针制得的微喷头的DBS卡。
[0041]图26是一组使用圆锥形C4zip-tip吸管尖的直接喷雾得到的人类血清中伊马替尼的质谱。含有伊马替尼的人类血清样品(各为1.5μυ通过多孔C4提取材料三次，接着将3yL甲醇添加到带有4kV正直流电压的zip-tip吸管尖以产生喷雾。图26A图示5yg/mL的MS谱。图26B显示5ng/mL情况下的MS/MS谱。
[0042]图27A的图显示本发明探针的不同针尖角。从左到右，针尖角分别为30度、45度、90度、112度、126度