用于NT-proBNP检测的新型免疫传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及新型免疫传感器的构建及其应用于心力衰竭标志物NT-proBNP(抗原)的快速检测，属于生物传感技术领域及临床检验新技术领域。
【背景技术】
[0002]心力衰竭(Heart Failure)又称“心肌衰竭”，是指心脏当时不能搏出同静脉回流及身体组织代谢所需相称的血液供应，它不是一个独立的疾病，是指各种病因致心脏病的严重阶段，比如心瓣膜疾病、冠状动脉硬化、高血压、内分泌疾患、细菌毒素、急性肺梗塞、肺气肿或其他慢性肺脏疾患等均可引起心脏病而产生心力衰竭的表现。心力衰竭是临床常见的疾病之一，由于早期心力衰竭常无明显的临床表现，目前通常是按心脏血管病进行常规检查，也根据患者的临床体征、影像学辅助检查并结合临床医生的经验诊断，而缺乏准确反映心功能不全的客观指标，造成许多无明显症状的心力衰竭患者得不到及时有效的治疗。因此，拓展和探寻心力衰竭早期、快速诊断的新指标，对进一步降低心血管不良事件，为患者的治疗提供准确参考，改善患者预后具有重要的临床意义。
[0003]心力衰竭作为一种临床常见病，在我国的患病率为0.9%，常需与支气管哮喘等疾病相鉴别。NT-proBNP是临床上常用于诊断和鉴别诊断心力衰竭的标志物，相比于其它标志物具有自己独特的生物学特性，如较长的半衰期，在体外较高的稳定性，以及高的敏感性和特异性。欧洲心脏病协会(ESC)在《急慢性心力衰竭诊断指南》中已经将NT-proBNP推荐为诊断心力衰竭的重要标志物。NT-proBNP的测定主要用于诊断心力衰竭、监测病程进展、对疗效和预后进行评估，同时用于急性心肌梗死患者在治疗后对其心室功能的恢复状况进行评估。当治疗有效时，NT-proBNP水平可明显下降，NT-proBNP水平的持续升高或持续不降低，通常提示患者的心衰未得到纠正或正进一步加重；在急诊室对呼吸急促患者的鉴别诊断，也可通过测定NT-proBNP水平准确检查出心衰患者引起的呼吸困难;NT-proBNP也是用于评价心脏外科手术患者的术前心脏功能的重要指标。可以说NT-proBNP是目前最好的评价心力衰竭的实验室检测指标，快速、敏感、特异地检测NT-proBNP对早期准确诊断心力衰竭和预后评估具有重要的意义。
[0004]目前临床上用于NT-proBNP测定的方法主要是ELISA(比如夹心法酶联免疫分析法)、电化学发光免疫分析法(比如罗氏Elecsys 6000电化学发光全自动免疫分析仪)等，但是存在灵敏度不够高，测定时间长，操作繁琐或价格昂贵等不足，急需开发高灵敏度、低成本、适宜床旁即时快速检测的新方法。
[0005]电化学免疫传感器是利用抗体-抗原反应，结合电化学方法构建的一种传感器。其基本原理为:首先通过化学共价键合、静电吸附和物理吸附等方法将抗体(一抗)修饰到电极表面，构成抗体修饰电极;根据抗体-抗原反应的特点，抗体(一抗)可特异性识别相应抗原，即可将抗原结合到电极表面。然后通过酶标抗体(二抗)与抗原特异反应，将酶修饰到电极表面，最后利用酶联催化放大技术与电化学分析技术相结合对抗原标志物进行检测。电化学免疫传感器具有灵敏度高、响应快、操作简便、微型化等显著优点，目前作为一项新的技术已被广泛用于检测肿瘤标记物、农药残留和细菌毒素等多种物质。目前，将纳米材料应用于构建电化学免疫传感器成为目前研究的热点，随着研究的不断深入，高灵敏度和高特异性的电化学免疫传感器将得以快速发展，以适应生命科学研究和临床医学的需要。
[0006]本发明设计了一种新的电化学免疫传感器，并将具有灵敏、简便、经济等优点的电化学免疫传感器用于血清NT-proBNP的检测，通过纳米复合材料修饰的电极和酶联放大信号技术及电化学分析技术，建立高灵敏度、高特异性、低成本的NT-proBNP检验方法，并为心衰的早期诊断以及预后评估提供一种新的、可推广的检测技术。从实用角度看，本项目提出的方法技术的成功开发，可以推广应用于其他疾病的早期诊断及预后评估，有望为临床诊断开辟一种新颖、简便、经济的新方法，具有潜在的应用价值和深远意义，并产生巨大的经济价值。
【发明内容】
[0007]本发明的第一个目的是提供一种新型的纳米电化学免疫传感器界面制备方法。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种用于低成本、高灵敏、快速的NT-proBNP的检测方法。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:本发明所述的一种用于NT-proBNP检测的新型免疫传感器，包括纳米复合材料、电极、抗原、抗体(一抗)、酶标抗体(二抗)、蛋白质、底物溶液，纳米复合材料采用AuNPs/roDA/RGO纳米复合物，电极采用玻碳电极，抗原采用NT-proBNP，蛋白质采用牛血清白蛋白，酶标抗体(二抗)采用辣根过氧化物酶标记，底物溶液采用TMB底物溶液，其特征是:利用纳米材料作为基底，通过纳米复合材料中的键合作用，使抗体(一抗)在传感器界面的固定量增大，且稳定性增强，所识别的抗原标志物增加，则结合到传感器表面的抗体(二抗)增加，通过酶联放大效应，使响应电流信号增大，采用电化学检测方法增强传感器检测灵敏度。
[0010]本发明所述的纳米复合材料的制备方法，包括如下步骤:
(I)由石墨粉通过改良的Hrnnmers法合成氧化石墨稀(GO)；
⑵将氧化石墨烯(GO)悬液与PDDA混合，采用超声法将混合物混匀，再加入N2H4形成混合物，将此混合物重新分散到超纯水中即可得到还原的氧化石墨烯与PDDA混合物(RG0/PDDA)；
(3 )将步骤(2 )制得的RG0/PDDA加入到AuNPs中，超声，再分散到超纯水中即可得到AuNPs/ PDDA/ RGO纳米复合物。
[0011]本发明所述的用于NT-proBNP检测的新型免疫传感器的制备方法，包括如下步骤:
(1)纳米复合材料的固定:将上述制备的AuNPs/FODA/RGO纳米复合物固定到电极表面，制备基底载体；
(2)抗体(一抗)的固定:将抗体(一抗)固定到基底载体表面，采用封闭液将电极表面的空白位点封闭，减少非特异性吸附；
(3)抗原标志物的识别:通过抗原抗体反应，使抗原标志物结合到电极表面，采用PBST冲洗基底表面，减少牛血清白蛋白和抗原的非特异性吸附。
[0012]所述的用于NT-proBNP检测的新型免疫传感器的制备方法，其特征是:包括如下步骤: (I)纳米复合材料的固定:将5yL的AuNPs/roDA/RGO纳米复合物滴涂到电极表面，25 °C条件下放置Ih，采用PBST冲洗电极表面，氮气吹干，获得基底电极；
(2 )抗体(一抗)的固定:将5 μ L抗体(一抗)滴涂到步骤(I)所制备的基底电极表面，4 °C下放置12h，将基底电极浸入lwt%牛血清白蛋白溶液中，37°C下温育lh，氮气吹干；
(3)抗原标志物的识别:37°C下将5yL抗原滴涂到步骤(2)所制备的基底电极表面，采用PBST冲洗基底电极表面，氮气吹干。
[0013]所述的用于NT-proBNP检测的新型免疫传感器的制备方法，其特征是:所述电极采用玻碳电极，所述玻碳电极按下述方法处理，玻碳电极分别用0.3 μηι、0.05 μπι ΑΙ2Ο3和双蒸水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、双蒸水超声清洗，将超声好的电极置于0.5 M H2SO4中，