一种无囊膜病毒量子点标记方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于病毒学及水产动物医学领域，具体涉及一种无囊膜病毒量子点标记方法，同时还涉及一种无囊膜病毒量子点标记方法的用途。
【背景技术】
[0002]作为无囊膜病毒的代表，呼肠孤病毒是呈二十面体、具有双层衣壳、含多节段双链RNA基因组的病原病毒。呼肠孤病毒的宿主范围极广，能感染人、脊椎动物(包括鱼类)、无脊椎动物和植物，能引起宿主严重的病毒病，如导致鱼类严重的出血病和高死亡率[张奇亚&桂建芳，2014，中国科学:生命科学，2014,44:1236-1252]。病毒入侵是其复制周期中至关重要的第一步。无囊膜病毒入侵宿主细胞的方式和过程与有囊膜病毒存在显著差异[Groveet al,J.Cell B1l,2011,195(7):1071-1082；White et al,Crit Rev B1chem MolB1l，2008;43(3):189-219]。为了高效防控病毒病，须对病原入侵过程进行实时监控。利用新型材料，建立精准、稳定的单病毒颗粒示踪技术，对了解无囊膜病毒是如何突破宿主屏障、入侵细胞的动态过程及病毒与宿主的相互作用，进而认识无囊膜病毒的致病机制，研发系列新的抗病毒药物及相关生物制剂具有重大意义。
[0003]近些年，通过在病毒的囊膜上进行量子点(Quantum dots，DQs)标记，可对有囊膜病毒进行不踪[Zhang et al，B1mater ial s，2013，34: 7506-7518 ; Zhang et al,Theranostics,2014,4(3): 307-315]。但是，由于无囊膜病毒缺少囊膜，尚无法按照现有方法直接对无囊膜病毒进行标记。若单独采用荧光染料标记，则受到耐光性较弱、生物相容范围有局限；而经基因操作用荧光蛋白标记，则可能使病毒的活性降低甚至丧失。因此，需建立既能应新型纳米材料量子点高抗光漂白性、长荧光寿命和宽生物相容性等优点[Zhao etal,Chem.Commun.2008,41: 5116-5118]，同时又适合对无囊膜病毒进行量子点标记的新技术。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是在于提供了一种无囊膜病毒量子点标记方法，该技术标记病毒颗粒稳定可靠，均一性好，适用于对无囊膜病毒进行标记。
[0005]本发明的另一个目的是在于提供了一种无囊膜病毒量子点标记方法的应用。将量子点标记的无囊膜病毒接种到在玻璃底小皿上长成单层的敏感细胞中，再用绿色荧光染料指示细胞特定组分(如用细胞质膜染料CellMask?染细胞膜)，置荧光显微镜下持续观察量子点标记无囊膜病毒(红色)与细胞特定组分的相对位置，可实时追踪病毒的运动轨迹。
[0006]这是一种针对无囊膜病毒长时间实时示踪的高效方法。经用外衣壳蛋白免疫荧光标记无囊膜病毒测试及Image Pro Plus软件计算，该方法标记无囊膜病毒的效率大于75%。
[0007]为了达到上述的目的，本发明采取以下技术措施:
[0008]—种无囊膜病毒量子点标记方法，包括如下步骤:
[0009]I)在无囊膜病毒悬液中，加入生物素孵育，进行无囊膜病毒的生物素化。
[0010]2)超速离心除去不完整的无囊膜病毒颗粒及其他杂质;先将生物素化的病毒悬液离心，收集沉淀，加入PBS缓冲液悬浮，经不连续蔗糖密度梯度(20 %、30 %、40 %、50 %及60% )离心，分别收集各离心条带，加PBS洗涤后离心，收集沉淀，重悬于TE缓冲液中，负染电镜观察，获得结构均一、生物素化的无囊膜病毒。
[0011]3)将步骤2)获得的生物素化无囊膜病毒接种于易感细胞，加量子点孵育，进行无囊膜病毒量子点标记。
[0012]以上所述的方法中，优选的，所述的无囊膜病毒为大菱鲆呼肠孤病毒(SMReV)。
[0013]以上所述的方法中，优选的，离心速度为110，OOOg，离心温度为4°C。
[0014]—种无囊膜病毒量子点标记方法的应用，包括该方法在监测无囊膜病毒侵染细胞过程中的应用，或是该方法在研究无囊膜病毒与宿主细胞互作中的应用；或是在筛选抗无囊膜病毒制剂中的应用。
[0015]具体的，利用所述的方法在监测无囊膜病毒侵染细胞过程中的应用的过程包括:量子点标记无囊膜病毒接种的细胞，用细胞质膜染料染色，荧光显微镜下对量子点标记无囊膜病毒的运动轨迹进行示踪；
[0016]利用所述的方法在研究无囊膜病毒与宿主细胞互作中的应用包括:单层细胞先利用融合荧光蛋白或荧光探针等对不同细胞组分进行荧光定位，再接种的生物素化无囊膜病毒，进行量子点标记。将细胞培养不同时间后固定，对量子点标记无囊膜病毒与共定位细胞组分进行荧光显微观察，以查明无囊膜病毒运动方向、轨迹及与细胞互作的组分。
[0017]利用所述的方法在筛选抗无囊膜病毒制剂中的应用包括:通过在生物素化无囊膜病毒或量子点标记无囊膜病毒与其他试剂作用后，是否能与特定细胞组分结合，来筛选抗无囊膜病毒的制剂。
[0018]基于上述方法，本发明对无囊膜病毒，如呼肠孤病毒入侵鱼类细胞的过程，可实时监测。通过构建不同融合基因质粒或荧光探针，还可对与无囊膜病毒作用的细胞组分(受体)进行标记和鉴定，尤其是可识别鱼类呼肠孤病毒在宿主细胞中的互作组分。另外，可通过在生物素化无囊膜病毒或量子点标记无囊膜病毒与其他试剂作用后，是否能与特定细胞组分结合，来筛选研制抗鱼类无囊膜病毒制剂。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0020]1.本发明实现对无囊膜病毒单颗粒进行量子点标记，通过量子点标记，可对无囊膜病毒颗粒进行长时间实时示踪。
[0021]2.本发明基于量子点标记、无囊膜病毒外衣壳蛋白免疫荧光标记、及细胞特定组分荧光蛋白定位相结合的策略，采用超离心分离替代脱盐柱除去未反应试剂，显著提高待标记无囊膜病毒的质量和数量，参照外衣壳蛋白标记，验证了量子点标记无囊膜病毒有性能优、效率高的特点。
[0022]3.利用本发明的示踪方法，不仅能精细准确示踪无囊膜病毒侵入细胞膜的轨迹；且获取无囊膜病毒在接种90min内，依次与宿主细胞早期内体、晚期内体和溶酶体共定位图像，直观展示无囊膜病毒SMReV是经内体一溶酶体系统进行胞质内运输。
[0023]4.本发明提供了一种在筛选研制抗鱼类无囊膜病毒制剂中的应用，是认识无囊膜病毒侵染机制和抗病毒制剂研发的有用工具。本发明还可广泛地应用于水产动物医学科学等领域。
[0024]5.利用本发明提供的无囊膜病毒量子点标记方法，标记效率可高达75%以上。
【附图说明】
[0025]图1为一种量子点标记和外衣壳蛋白免疫焚光标记的SMReV及在细胞周围的分布。
[0026]A.单个细胞的普光显微图』.C和D为荧光显微图，其中B.量子点标记无囊膜病毒SMReV(红色)；C.外衣壳蛋白免疫荧光标记无囊膜病毒SMReV(绿色)；D.为B和C的叠加图，红、绿色重叠(呈黄色)信号确定为量子点标记无囊膜病毒。标尺:5μπι。
[0027]图2为一种无囊膜病毒SMReV的运动轨迹。
[0028]量子点标记无囊膜病毒SMReV吸附(a，示完整细胞)和穿过细胞膜进入胞质的时序变化(Os，7s，IIs和13s，细胞膜局部放大)。刚开始量子点标记无囊膜病毒SMReV与囊膜共定位(a和Os，呈黄色)，随时间延长，量子点标记无囊膜病毒(红色)逐渐脱离细胞膜(绿色)，进入胞质中(13s)。
[0029]图3为一种量子点标记无囊膜病毒SMReV(红色)与细胞内体一溶酶体系统(绿色)共定位图像。
[0030]Rab5:在30min时，SMReV主要与早期内体共定位。Rab7:在60min时，SMReV主要与晚期内体共定位;Lysosome:在90min时，SMReV主要与溶酶体共定位。标尺:5μηι。
【具体实施方式】
[0031]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例以对SMReV的标记方法和应用来进一步阐述，但所述的方法和应用并不限于SMReV。
[0032]实施例1:
[0033]无囊膜病毒量子点的标记方法及标记效率
[0034]I) SMRe V 扩增培养:
[0035]按常规方法，将草鱼鳍条细胞系(GCF)[Ke et al.BMC Genomics 2011，12:323]进行传代培养，16h后细胞长成单层，每25cm2培养瓶细胞接种ΙΟΟμΙ大菱鲆呼肠孤病毒(SMReV)原液，置于20°C培养，7天后收集病变细胞，反复冻融3次。4°C差异(4，000g与12，OOOg)离心20min，收集上清，获得大菱鲆呼肠孤病毒SMReV悬液。
[0036]2)在含17个RNA拷贝的300mL的SMReV悬液中，加入浓度为0.0lmg/μΙ的生物素(sulfo-NHS-LC