一种基于ssr分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物学的分子标记领域，具体涉及一种基于SSR分子标记鉴别扁 桃属植物种质的方法。
【背景技术】
[0002] 扁桃，俗称巴旦杏，为蔷薇科李亚科桃属扁桃属植物，我国现有分布的扁桃属植物 种质资源包括野生和栽培种共6种，主要分布在新疆天山以南的喀什地区；新疆准葛尔盆地 西部的巴尔鲁克山、塔尔巴哈台山和阿尔泰山等山地；内蒙古乌拉山、大青山；宁夏贺兰山； 青藏高原东端等地。分别是普通扁桃Amygdalus. communis L.、新疆野扁桃 Amygdalus. ledebouriana Schlecht ·、蒙古扁桃Amygdalus .mongolica Moxim.、长柄扁桃 Amygdalus . pedunculata Pal 1 ·、西康扁桃Amygdalus · tangutica Batal ·、输叶梅 Amygdalus·triloba(Lindl)Ricker·〇
[0003] 扁桃作为普通扁桃栽培种的历史十分悠久，大约在4000年前，扁桃在其原产地西 亚地区就已被引种栽培。由于气候环境等条件的限制，目前在世界范围内只有中国新疆，美 国加利福利亚州，西亚的伊朗，南欧的意大利西班亚等地有栽培。我国栽培普通扁桃已有 1300多年的历史，主要分布在新疆天山以南喀什地区的英吉沙及莎车等地。由于长期的实 生繁殖和自然演化，形成了丰富的资源，栽培品种、品系以及优良单株有近百个，这些资源 形态各异，关系复杂，多数品种谱系不清，同名异物或同物异名的现象普遍，这给扁桃的分 类、栽培以及品种选育带来很大困难。
[0004] 本发明重点立足于新疆的扁桃资源，包括分布于新疆的5个不同群体的新疆野扁 桃的类型，同时对引进栽培的美国扁桃品种资源（即所谓的美国大杏仁)及分布于我国的扁 桃属植物种进行SSR分子标记和聚类分析。SSR也称微卫星标记，是由长度为1 一 6个碱基的 基元，串联重复而成的，广泛分布于基因组中。SSR是基因组中变异最为迅速的序列，其串联 重复数的突变率很高，从而产生了很多等位基因，形成了SSR的高度多态性。SSR标记是基于 PCR扩增的分子标记，呈共显性，引物由待检物种的基因组序列开发而来，物种特异性强，不 易受内生及外源微生物基因组的影响，结果准确可靠，正是基于这些优点，国际植物品种权 保护组织(UP0V)于2007年将SSR与最新发展的SNP标记一起确定为构建DNA指纹数据库的标 记方法。
[0005] 本发明旨在研究我国扁桃类植物种质包括引进的各个种、品种之间的亲缘关系。 建立一套简便、快速、可靠的扁桃属植物种质鉴定技术体系应用于该属种质资源的鉴定，进 行种质及品种权利保护，对于维护育种者和生产者的利益，保障该产业健康发展，具有重要 而现实的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于:提供一种基于SSR分子标记技术鉴别扁桃属植物种质的方法， 该方法通过选择多态性高的SSR引物，对国内外55份扁桃属植物种质材料进行SSR-PCR扩 增反应、电泳检测、统计分析。结果表明：使用筛选自核果类的100对SSR引物中的10对多态 性强的引物对扁桃属植物种质材料，包括国内外栽培品种及不同种的55个个体样本的基因 组DNA进行SSR-PCR扩增，获得了较好的扩增结果。10对引物共扩增出63条扩增条带，其中多 态带60条，多态率为95.2 %。通过进行相似系数和聚类分析，遗传相似系数为0.4133 - 0.9600，平均相似系数为0.6867;聚类分析将些类种质材料划分为6个大类，55份扁桃类植 物种质间的遗传差异表明：不同种以及不同品种间的遗传距离不同，在相似系数小于0.68 时，大多数栽培品种聚为一类，栽培品种中，同一种源区的大多数栽培品种能聚类在一起。 普通栽培扁桃与新疆野扁桃间的未缘关系比长柄扁桃、蒙古扁桃、西康扁桃以及榆叶梅间 的亲缘关系更近，为进一步区分扁桃类植物种质资源亲缘关系远近提供了重要途径。该方 法较之常规的形态学、细胞学、生化标记鉴定等传统方法更为简便、直观、真实，可方便地应 用于扁桃属植物种质区分、鉴定、查对、交换、管理、利用。其开放性更利于同行间的交流和 共享，为进一步的优良育种目的提供鉴定技术体系。
[0007] 本发明提供一种基于SSR分子标记技术鉴别扁桃属植物种质的方法，按下列步骤 进行：
[0008] 准备扁桃属植物种质材料：
[0009] a、早春季，选取健壮、无病虫害的扁桃属植物55份样本的新鲜嫩叶，每份样本以液 氮冷冻后放入温度一 70°C超低温冰箱中保存备用；
[0010] 扁桃属植物种质DNA的提取：
[0011] b、迅速加入1000yL，温度65°C预热的含2 %十六烷基三甲基溴化铵，1.4M氯化钠， 20mM四乙酸二氨基乙烯，1 OOmM三羟甲基氨基甲烷，pH8.0的缓冲液和8 %巯基乙醇的缓冲 液，轻轻摇匀;置于温度65°C水浴锅中温浴60min，其间每隔10min轻轻上下晃动摇匀1次，使 溶液充分裂解;采用台式离心机离心，温度21°C，转速10000r/min，时间15min，吸取上清液， 将上清液平均分配转入另外两个新的1500yL离心管中，其中每个离心管中均含有480yL上 清液;将每个含有上清液的离心管中加入等体积的氯仿：异戊醇=24:1，轻轻上下晃动摇 匀，离心，温度21°C，转速10000r/min，时间15min，吸取上清液，将每个离心管中的上清液合 并，转入另一个新的1500此离心管中，离心管中含有600yL上清液;将装有600yL上清液的离 心管中加入等体积的氯仿：异戊醇= 24:1，轻轻上下晃动摇匀，离心，温度21°C，转速 10000r/min，时间15min，再吸取上清液，将上清液转入另一个新的1500yL离心管中，离心管 中含有400yL上清液;将装有400yL上清液的离心管中加入2倍体积的冷冻无水乙醇，放入温 度-20°C冷冻冰箱，时间30min，离心，温度21°C，转速10000r/min，时间15min后有清晰乳白 色的DNA白絮沉淀，去除上部液体;再将乳白色的DNA白絮沉淀用浓度为70 %的乙醇洗涤2-3 次，自然风干后，溶于50此含有10mM三羟甲基氨基甲烷，ImM四乙酸二氨基乙烯，pH8.0的缓 冲溶液中，温度_20°C冰箱保存；
[0012] C、用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度;将步骤b得到的DNA浓度稀释至50ngAi 1后，置于温度一 20°C冰箱中备用；
[0013] d、SSR引物筛选：
[0014] 根据NCBI数据库上搜索，从来源于核果类果树作物的100对SSR引物中通过初筛和 复筛，最终选出10对产物主带明显并且多态性较好的引物进行SSR微卫星分子标记分析，其 中SSR 10对标记为：
[0015] 标记 1BPPCT002，其上游引物5 ' TCGACAGCTTGATCTTGACC，下游引物5 ' CAATGCCTACGGAGATAAAAGAC；
[0016] 标记2BPPCT004，其上游引物5 ' CTGAGTGATCCATTTGCAGG，下游引物5 ' AGGGCATCTAGACCTCATTGTT；
[0017] 标记3BPPCT032，其上游引物5 ' TTAAGCCACAACATCCATGAT，下游引物5 ' AATGGTCTAAGGAGCACACG；
[0018] 标记4BPPCT036，其上游引物5 ' AAGCAAAGTCCATAAAAACGC，下游引物5 ' GGACGAAGACGCTCCATT；
[0019] 标记5BPPCT040，其上游引物5 ' ATGAGGACGTGTCTGAATGG，下游引物5 ' AGCCAAACCCCTCTTATACG；
[0020] 标记6Pchgms 1，其上游引物5 ' GGGTAAATATGCCCATTGTGCAATC，下游引物5