专利名称:破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用途的制作方法
破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用途
发明领域
本发明涉及分离的破囊壶菌(thraustochytrid)微生物及其菌株和变体。本发明还涉及破囊壶菌生物质、微生物油、组合物、培养物、生产微生物油的方法和使用分离破囊壶菌、生物质及微生物油的方法。
背景领域
脂肪酸基于碳链长度和饱和特性分类。短链脂肪酸通常具有12个碳或更少，中链脂肪酸通常具有14到18个碳，长链脂肪酸通常具有20个或更多碳。碳原子间不存在双键时脂肪酸定义为饱和脂肪酸且在双键存在时定义为不饱和脂肪酸。仅存在一个双键时不饱和长链脂肪酸是单不饱和且存在大于一个双键时是多不饱和。
多不饱和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一个双键位置分类。 Ω-3(η-3)脂肪酸在第三个碳上包含第一个双键，而Ω-6(η-6)脂肪酸在第六个碳上包含第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA")是Ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)， 具有22个碳的链长度和6个双键，通常标为〃 22:6 η-3 “。其他Ω-3 LC-PUFA包括标为"20:5 η-3"的二十碳五烯酸(〃 EPA")和标为〃 22:5 η-3"的Ω-3二十二碳五烯酸 (“DPA η-3" )。DHA和EPA定义为“必需”脂肪酸。Ω-6 LC-PUFA包括标为〃 20:4 η_6" 的花生四烯酸(〃 ARA")和标为〃 22:5 η-6〃的Ω-6 二十二碳五烯酸(〃 DPA η_6〃)。
Ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于其在细胞膜的存在而影响细胞生理学， 调节生物活性化合物的生成和基因表达，且用作生物合成底物。Roche，H. Μ.，Proc. Nutr. Soc. 58 :397-401 (1999)。例如，DHA占人大脑皮层中脂质的约15% _20%、视网膜中脂质的约30%-60%，其集中于睾丸和精液中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Berge 和Gilles Barnathan，“来自海洋生物脂质的脂肪酸分子生物多样性，作为生物标记的作用，生物活性化合物和经济方面”(Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds, and Economical Aspects)，《海 # L *》(Marine Biotechnology) I 49 (T. Scheper H, 2005)。DHA占大脑中Ω-3脂肪酸的多达97%和视网膜中Ω-3脂肪酸的多达93%。此夕卜， DHA对胎儿和婴儿发育以及维持成人中的认知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在内的 Ω-3脂肪酸也具有抗炎特性。参见例如同上以及Simopoulos，A.P.，J.Am. Coll.Nutr. 21 495-595(2002)。由于Ω-3脂肪酸不在人体内从头合成，这些脂肪酸必须获得自营养源。
亚麻籽油和鱼油被视作Ω -3脂肪酸的良好膳食来源。亚麻籽油不含EPA、DHA、DPA 或ARA，但含有能使身体生成EPA的基础成分亚麻酸(C18:3 η-3) 0然而，有证据显示代谢转化率可以较慢且可变，特别是在健康受损的机体中。鱼油在脂肪酸组成的类型和水平上差异很大，这取决于具体物种和其饮食。例如，水产养殖的鱼往往Ω-3脂肪酸水平低于野生鱼。此外，鱼油具有含环境污染物的风险并可能涉及稳定性问题和鱼腥味或口味。
破囊壶菌是破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(khizochytrium)的成员且被认为是包括DHA在内的Ω-3脂肪酸的替代来源。参见美国专利第5，130，242号。这些海洋异养微生物生成的油通常具有比相应鱼或微藻油更简单的多不饱和脂肪酸分布。Lewis, Τ. Ε.，Mar. Biotechnol. 1 :580-587 (1999)。据报道，破囊壶菌菌株以该生物体所产生总脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。美国专利第 5，130，242 号；Huang，J.等，J. Am. Oil. Chem. Soc. 78 :605-610(2001) ；Huang, J.等，Mar. Biotechnol. 5 =450-457(2003)。然而，分离的破囊壶菌在生成LC-PUFA的特性和量上不同， 从而一些前述菌株可能具有的Ω-6脂肪酸水平不理想和/或在培养中表现出低生产率。由此，从营养源中分离出证明有高生产率和理想LC-PUFA分布的破囊壶菌的需求一直存在。
发明概述
本发明涉及以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌物种的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
本发明也涉及具有以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌物种特征的分离破囊壶菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
本发明也涉及含有甘油三酯组分的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸η-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
本发明也涉及与以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌物种同种的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％ 或更少的二十碳五烯酸。
在一些实施方式中，本发明衍生自分离破囊壶菌微生物的菌株是突变菌株。
本发明也涉及以ATCC 登录号 ΡΤΑ-9695、ΡΤΑ-9696、ΡΤΑ-9697 或 ΡΤΑ-9698 保藏的分离微生物。
本发明也涉及含任意一种本发明破囊壶菌微生物或其混合物的破囊壶菌生物质。
本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约50重量％的生物质细胞干重是脂肪酸，且其中至少约50重量％的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些实施方式中，至少约50 重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸。本发明还涉及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约25 重量％的生物质细胞干重是二十二碳六烯酸。
在一些实施方式中，本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其中约10重量％或更少的脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中二十二碳六烯酸与二十碳五烯酸的重量比为至少约 5 I0
在一些实施方式中，本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其中约1.5重量％ 或更少的脂肪酸是花生四烯酸，且其中二十二碳六烯酸与花生四烯酸的重量比为至少约 20 1。
在一些实施方式中，本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其含有的二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸η-6的重量比为至少约10 1。
本发明也涉及含任意一种本发明破囊壶菌微生物或其混合物的分离破囊壶菌培养物。在一些实施方式中，所述培养物包括至少约5%的溶解氧。
本发明也涉及用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包含本发明破囊壶菌微生物或生物质中的任何一种或其混合物。
本发明也涉及含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约50重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为约0. 5重量％ -约6重量％。在一些实施方式中，所述微生物油还包括占所述甘油三酯组分约1. 5重量％或更少的花生四烯酸含量。
本发明也涉及含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比例为大于约6 1。
本发明也涉及含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约60重量％。
在一些实施方式中，所述微生物油甘油三酯组分的至少约20%甘油三酯在所述甘油三酯内的两个位置上含有二十二碳六烯酸，所述位置选自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任意两个。在一些实施方式中，所述微生物油甘油三酯组分的至少约5%甘油三酯在所述甘油三酯中sn-1、sn-2和sn-3三个位置都含有二十二碳六烯酸。
在一些实施方式中，所述微生物油还包括约5重量％或更少的十七酸。
本发明也涉及用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包含本发明的任何微生物油。在一些实施方式中，所述食品是婴儿配方。在一些实施方式中，所述婴儿配方适合早产儿。在一些实施方式中，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养素饮料或其组合。 在一些实施方式中，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。在一些实施方式中，所述食品是营养补充品。在一些实施方式中，所述食品是动物饲料。在一些实施方式中，所述动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方式中，所述动物饲料是牲畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、家畜饲料或其组合。
本发明也涉及含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，该方法包括(a)使本发明的任何一种分离破囊壶菌微生物或其混合物在培养物中生长以生成生物质，和(b)从所述生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述培养物包括至少约5%的溶解氧。在一些实施方式中，所述培养物PH维持在约6. 5-约8.5。在一些实施方式中，所述培养物温度维持在约17°C -约30°C。在一些实施方式中，所述培养物包括约5g/L-约50g/L 浓度的葡萄糖。
本发明也涉及含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，该方法包括从本发明任何一种生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述微生物油用己烷提取方法提取。在一些实施方式中，微生物油用无溶剂提取方法提取。
在一些实施方式中，在ρΗ约6. 5-约8. 0的培养基中约17°C -约30°C生长7天后， 从每升本发明任何培养物中分离的生物质干细胞重为至少约50g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。
在一些实施方式中，在ρΗ约6. 5-约8. 0的培养基中约17°C -约30°C生长7天后， 本发明的任何一种分离培养物的Ω -3脂肪酸生产率为至少约2克/升/天，所述培养基包含碳源、氮源和营养素及约950ppm-约8500ppm氯离子。
本发明也涉及通过本发明方法产生的微生物油。[0033]本发明也涉及采用本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物生产治疗炎症或其相关病症的药物。
本发明也涉及采用本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物治疗炎症或其相关病症。
本发明也涉及用于治疗炎症或其相关病症的本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物。
本发明也涉及在需要的对象中治疗炎症或其相关病症的方法，包括将本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物以及药学上可接受载体给予对象。
发明详述
本发明涉及分离的破囊壶菌微生物及其菌株和突变体，以及其生物质、微生物油、 组合物和培养物。本发明还涉及从本发明的破囊壶菌生成微生物油的方法和使用破囊壶菌、生物质及微生物油的方法。本文所述的破囊壶菌与现有分离物相比较高产，并生成独特脂肪酸分布，其部分特征是高水平的Ω-3脂肪酸，具体是高水平的DHA。
破囊壶菌微生物
本发明涉及分离的破囊壶菌，包括其突变体、重组体和变体。
在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌。所述分离的破囊壶菌在本文中也称为裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC ΡΤΑ-9695。ATCC登录号 ΡΤΑ-9695相关破囊壶菌于2009年1月7日根据布达佩斯条约保藏于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，专利保藏所(Patent D印ository)，弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801,20110-2209)。
在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的分离的破囊壶菌菌株。在一些实施方式中，本发明涉及与以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌同种的分离破囊壶菌微生物。
在一些实施方式中，本发明涉及具有以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌特征的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株。以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌的特征包括生长和表型特征(表型特征例子包括形态和增殖特性)、其物理和化学性质(如干重和脂质分布)和其基因序列。在一些实施方式中，本发明的分离破囊壶菌具有与以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌几乎相同的表型特征。在一些实施方式中，本发明的分离破囊壶菌具有与以ATCC登录号ΡΤΑ-9695保藏的破囊壶菌几乎相同的生长特性。
在一些实施方式中，本发明涉及本发明的分离破囊壶菌的突变体、变体或重组体， 其中所述突变体、变体或重组体生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。 突变菌株可通过熟知的方法生成。常用方法包括辐射；高温处理；诱变剂处理。变异菌株可以是本文所述物种的其他天然产生的分离物和/或亚分离物。重组菌株可通过分子生物学中表达外源基因或改变内源基因功能或表达的熟知方法生成。在一些实施方式中，所述突变、变异或重组菌株比野生型菌株产生更高量的Ω-3脂肪酸，包括DHA和/或ΕΡΑ。在一些实施方式中，所述突变、变异或重组菌株产生较低量的一种或多种脂肪酸，如较低量的ΕΡΑ、 ARA, DPA η-6或其组合。在一些实施方式中，在每升培养物中，所述突变、变异或重组菌株产生比野生型菌株更大的细胞干重。这些突变、变异或重组菌株是本发明的分离破囊壶菌衍生菌株的例子。
8[0045]在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌突变菌株。在进一步的实施方式中，所述突变菌株是以ATCC登录号PTA-9696、PTA-9697或 PTA-9698保藏的菌株。ATCC登录号PTA-9696、PTA-9697和PTA-9698相关破囊壶菌菌株于2009年1月7日根据布达佩斯条约保藏于美国模式培养保藏所，专利保藏所(Intent D印ository)，弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801，20110-2209。这些保藏的突变菌株是以 ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的衍生物。
在一些实施方式中，包括突变体、变体或重组体在内的本发明的分离破囊壶菌包括分离自破囊壶菌的一个或多个组分的脂肪酸分布。所述分离自破囊壶菌的一个或多个组分包括总脂肪酸组分、留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合。
破囊壶菌培养物和分离的破囊壶菌生物质
本发明还涉及含一种或多种本发明的分离破囊壶菌的培养物。接种、培养和回收微菌落的不同发酵参数在本领域已知，如美国专利第5，130，242号所述。可使用任何常规培养基培养破囊壶菌。液体或固体培养基可包含天然或人工海水。碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、岩藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、 醋酸钠和甘露醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母膏、多价蛋白胨、麦芽膏、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、有机氮源、谷氨酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硫酸钠。一种典型的培养基示于表1
表1 容器培养基
成分浓度范围
NaClg/L 12.50-25，5-20，或 10-15
KClg/L 1.00-5，0.25-3,或 0.5-2
MgS04'7H20 g/L 5.00-10, 2-8,或 3-6
(NH4)2SO4 g/L 0.60-10, 0.25-5,或 0.5-3
CaCl2g/L 0.290.1-5，0.15-3,或 0.2-1
T 154(酵母膏)g/L6.00-20,1-15，或 5-10
KH2PO4g/L 1.20.1-10，0.5-5，或 1-3
高压灭菌后(金属)
柠檬酸mg/L 3.50.1-100, 1-50,或 2-25
FeSO4 TH2O mg/L 10.300.1-100, 1-50，或 5-25
MnCl2.4H20 mg/L 3.100.1-100, 1-50,或 2-25
ZnSO4 TH2O mg/L 3.100.1-100，1-50,或 2-25
CoCl2-6H20 mg/L 0.040.001-1，0.005-0.5,或 0.01-0.1
Na2MoO4-2H20 mg/L 0.040.001-1, 0.005-0.5,或 0.01-0.1
CuSO4-5H20 mg/L 2.070.1-100, 0.5-50,或 1-25
NiSO4.6H20 mg/L 2.070.1-100，0.5-50，或 1-25
高压灭菌后(维生素)
硫胺素** mg/L 9.750.1-100, 1-50,或 5-25
维生素 B12** mg/L 0.160.1-100, 0.1-10,或 0.1-1
CaV2-泛酸盐** mg/L 3.330.1-100, 0.1-50,或 1-10
高压灭菌后(碳)
葡萄糖g/L 30.05-150, 10-100，或 20-50
氮供料
成分浓度
NH4OH mL/L 21.6 0-150, 10-100,或 15-50
典型的培养条件包括下列
pH约 6.5-约 8.5,约 6.5-约 8.0，或约 7.0-约 7.5
温度约17-约30摄氏度，约20-约25摄氏度，
或约22-约23摄氏度 溶解氧约5-约100%饱和，约10-约80%饱和，
或约20-约50%饱和 控制葡萄糖 :约5-约50 g/L，约10-约40 g/L,或约20-约35 g/L。
在一些实施方式中，所述培养基包括至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约80 %或至少约90 %溶解氧(作为饱和水平的百分比)。在一些实施方式中，所述培养基包括约5%-约20%、约 5% -约 50%、约 5% -约 100%、约 10% -约 20%、约 10% -约 50%、约 10% -约 100%、 约20% -约50%、或约20% -约100%溶解氧(作为饱和水平的百分比)。
本发明还涉及本发明破囊壶菌的分离生物质。本发明的分离破囊壶菌生物质是通过分离破囊壶菌生物质的任何常规方法获得的收集细胞生物质，如美国专利第5，130，242 号和美国申请公开号2002/0001833所述。
在一些实施方式中，在pH约6. 5-约8. 5的培养基中约17°C -约30°C生长约7 天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约 80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g、或至少约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。在一些实施方式中，在pH约 6. 5、约7、约7. 5、约8. 0或约8. 5的培养基中约17°C、约18°C、约19°C、约20°C、约21°C、 约 22°C、约 23°C、约 M°C、约 25°C、约 ^°C、约 27°C、约 ^°C、约 ^°C、或约 30°C生长约 7 天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约 80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g、或至少约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。在一些实施方式中，在pH 约6. 5-约8. 5的培养基中约17°C -约30°C生长约7天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为约50g-约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。 在一些实施方式中，在PH约6. 5、约7、约7. 5、约8. 0或约8. 5的培养基中约17°〇、约181、 约 19°C、约 20°C、约 21°C、约 22°C、约 23°C、约 M°C、约 25°C、约 ^°C、约 27°C、约 ^°C、约 ^°C、或约30°C生长约7天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为约50g-约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。
在一些实施方式中，分离的破囊壶菌培养物在pH约6. 5-约8. 5的培养基中约 17°C -约30°C生长约7天后Ω -3脂肪酸生产率为至少约2克/升/天、至少约4克/升/ 天、或至少约8克/升/天，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。在一些实施方式中，分离的破囊壶菌培养物在PH约6. 5-约8. 5的培养基中约17°C -约 30 0C生长约7天后Ω -3脂肪酸生产率为约1克/升/天-约20克/升/天、约2克/升/ 天-约15克/升/天、约2克/升/天-约10克/升/天、约3克/升/天-约10克/升 /天、或约4克/升/天-约9克/升/天，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约 8500ppm氯离子。
在一些实施方式中，所述发酵体积(培养体积)为至少约2升、至少约10升、至少约50升、至少约100升、至少约200升、至少约500升、至少约1000升、至少约10，000升、至少约20，000升、至少约50，000升、至少约100，000升、至少约150，000升、至少约200，000 升、或至少约250，000升。在一些实施方式中，所述发酵体积是约2升-约300，000升，约 2升、约10升、约50升、约100升、约200升、约500升、约1000升、约10，000升、约20，000 升、约 50，000 升、约 100，000 升、约 150，000 升、约 200，000 升、约 250，000 升、或约 300，000 升。
在一些实施方式中，本发明涉及含本发明脂肪酸分布的分离破囊壶菌生物质。在一些实施方式中，至少约50%、至少约60 %、至少约70 %或至少约80 %的生物质细胞干重是脂肪酸。在一些实施方式中，大于约50%、大于约55%或大于约60%的生物质细胞干重是脂肪酸。在一些实施方式中，约50% -约60%、约50% -约70%、约50% -约80%、约 55 % -约70 %、约55 % -约80 %、约60 % -约70 %、或约60 % -约80 %重量的生物质细胞干重是脂肪酸。在一些实施方式中，所述生物质中至少约50%、至少约60%、至少约70%或至少约80%重量的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些实施方式中，所述生物质中约50%-约 60 %、约50% -约70%、约50% -约80%重量的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些实施方式中，所述生物质中至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%或至少约80%重量的脂肪酸是DHA。在一些实施方式中，所述生物质中至少约 50% -约60%、约50% -约70%、或约50% -约80%重量的脂肪酸是DHA。在一些实施方式中，至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、或至少约60%重量的生物质细胞干重是二十二碳六烯酸。在一些实施方式中，约25% -约65%、约25% -约50%、约 30% -约40%、或约25% -约35%重量的生物质细胞干重是二十二碳六烯酸。在一些实施方式中，所述生物质中约10 %或更少、约9 %或更少、约8 %或更少、约7 %或更少、约6 %或更少、约5 %或更少、约4 %或更少、约3 %或更少、约2 %或更少、或约1 %或更少重量的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些实施方式中，所述生物质中约-约10%、约-约5%、约2% -约 5 %、约3 % -约5 %、或约3 % -约10 %重量的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些实施方式中，所述生物质中几乎没有ΕΡΑ。在一些实施方式中，所述生物质包含的DHA与EPA重量比为至少约 5 1、至少约7 1、至少约10 1、至少约11 1、至少约14 1、至少约15 1、至少约 17 1、至少约20 1、至少约25 1、至少约50 1、或至少约100 1，其中所述生物质中约10%或更少重量的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些实施方式中，所述生物质中约0. 1 % -0. 2%、 约 0. 1%-约0.3%、约0. 1%-约0.4%、约0. -约 0. 5%、或约 0. 1%-约 1.5%重量的脂肪酸是ARA。在一些实施方式中，所述生物质中约1.5%或更少、约或更少、约0.5% 或更少、约0. 4%或更少、约0. 3 %或更少、约0. 2 %或更少、或约0. 1 %或更少重量的脂肪酸是ARA。在一些实施方式中，所述生物质几乎没有ARA。在一些实施方式中，所述生物质包含的DHA与ARA重量比为至少约20 1、至少约40 1、至少约60 1、至少约80 1、 至少约100 1、至少约150 1、至少约200 1、至少约250 1、或至少约300 1。在一些实施方式中，所述生物质中约0. 5% -约1%、约0. 5% -约2%、约0. 5% -约5%、约 0. 5% -约6%、约-约5%、约-约6%、约2% -约5%、或约2% -约6%重量的脂肪酸是DPA η-6。在一些实施方式中，所述生物质中约6 %或更少、约5 %或更少、约2 %或更少、约或更少、或约0.5%或更少重量的脂肪酸是DPA η-6。在一些实施方式中，所述生物质几乎没有DPA η-6。在一些实施方式中，所述生物质包含的DHA与DPA η_6重量比为大
12于约6 1、至少约8 1、至少约10 1、至少约15 1、至少约20 1、至少约25 1、 至少约50 1、或至少约100 1。在一些实施方式中，所述生物质包含脂肪酸，其具有各自占约5 %或更少、约4 %或更少、约3 %或更少、或约2 %或更少重量的亚油酸(18:2 n-6)、 亚麻酸(18:3 n-3)、二十烯酸 00:1 n_9)和芥酸 02:1 n_9)。
本发明的分离生物质的特征与分离生物质的内源或天然特性，而不是外源引入物质相关。
微生物油
本发明还涉及生成微生物油的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使本发明的破囊壶菌在培养物中生长以生成生物质并从该生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。所述油可从新收集的生物质中提取或从以前收集的在防止酸败条件下保存的生物质中提取。可采用已知方法培养本发明的破囊壶菌，从培养物中分离生物质，从该生物质中提取微生物油，并分析从该生物质提取的油的脂肪酸分布。参见例如美国专利第5，130，242号。
本发明还涉及含有本发明脂肪酸分布的微生物油。本发明的微生物油可以是衍生自微生物的任何油，包括例如从所述微生物生物质提取而没有进一步加工的粗油；用进一步加工步骤如精炼、漂白和/或脱臭处理粗微生物油获得的精制油；通过稀释粗制或精制微生物油获得的稀释微生物油；或者例如用更多纯化方法处理粗制或精制微生物油以增加油中脂肪酸(如DHA)浓度而获得的富集油。
在一些实施方式中，所述微生物油包括约0%、至少约0. 1%、至少约0. 2%、至少约0.5%、至少约1%、至少约1.5%、至少约2%、或至少约5%重量的留醇酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约0% -约1.5%、约0%-约2%、约0%-约5%、约
-约1. 5%、约0. 2% -约1. 5%、约0. 2% -约2%、或约0. 2% -约5%重量的甾醇酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约5%、小于约4%、小于约3%、或小于约 2%重量的留醇酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约65%、至少约70%、 至少约75%、至少约80%、至少约85%、或至少约90%重量的甘油三酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约65% -约95%、约75% -约95%或约80% -约95%重量，或约97%重量或约98%重量的甘油三酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约0. 5%、至少约1%、至少约1. 5%、至少约2%、至少约2. 5%、或至少约5%重量的游离脂肪酸组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约0.5% -约5%、约0.5% -约2.5%、 约 0. 5% -约 2%、约 0. 5% -约 1. 5%、约 0. 5% -约 1%、约 -约 2. 5%、约 -约 5 %、约1. 5 % -约2. 5 %、约2 % -约2. 5 %、或约2 % -约5 %重量的游离脂肪酸组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%、或小于约重量的游离脂肪酸组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约0. 5%、至少约1%、至少约1.5%、至少约2%、或至少约5%重量的甾醇组分。在一些实施方式中， 所述微生物油包括约0. 5% -约1. 5%、约-约1. 5%、约0. 5% -约2%、约0. 5% -约 5%、约1%-约2(%、或约1(%-约5%重量的甾醇组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%、或小于约重量的甾醇组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约1. 5%、至少约2%、至少约2. 5%、至少约3%、至少约3. 5%、或至少约5%重量的甘油二酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约 1. 5% -约 3%、约 2% -约 3%、约 1. 5% -约 3. 5%、约 1. 5% -约 5%、约 2. 5% -约 3%、约2. 5% -约3. 5%、或约2. 5% -约5%重量的甘油二酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约2%、小于约1.5%、小于约1%、或小于约0.5%重量油的不皂化物。存在于所述微生物油中的脂类如甘油三酯组分，可通过快速层析分离并通过薄层层析(TLC) 分析，或通过本领域已知的其他方法分离和分析。
在一些实施方式中，所述微生物油和/或其选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、 甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、或至少约80% 重量的DHA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或其选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括约40%-约45%、约40%-约 50%、约 40% -约 60%、约 50% -约 60%、约 55%-约 60%、约 40% -约 65%、约 50% -约 65%、约 55% -约 65%、约 40% -约 70%、约 40% -约 80%、约 50% -约 80%、约 55% -约 80 %、约60 % -约80 %、或约70 % -约80 %重量的DHA。在一些实施方式中，所述微生物油含有的留醇酯组分包括约45 %或更少、约40 %或更少、约35 %或更少、约30 %或更少、约 25%或更少、约20%或更少、约15%或更少、或约13%或更少重量的DHA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括约10%或更少、约9%或更少、约8%或更少、约7%或更少、 约6 %或更少、约5 %或更少、约4 %或更少、约3 %或更少、约2 %或更少、或约1 %或更少重量的EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括约2% -约3%、约2% -约3. 5%, 约 2. 5% -约 3. 5%、2% -约 6%、约 2. 5% -约 6%、约 3. 0% -约 6%、约 3. 5% -约 6%、 约5% -约6%、或约2% -约10%重量的EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分几乎没有EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与EPA的重量比为至少约 5 1、至少约7 1、至少约9 1、至少约10 1、至少约15 1、至少约20 1、至少约 25 1、至少约30 1、或至少约50 1，其中所述微生物油和/或其一个或多个组分包括 10%或更少重量的EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与EPA的重量比为至少5 1，但小于约20 1。在一些实施方式中，DHA与EPA的重量比为约5 1-约18 1、约7 1-约16 1、或约10 1-约 15 1。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约 0. -约 0. 25%、约 0. 2% -约 0. 25%、约 0. -约 0. 5%、或约 0. -约 1. 5% 重量的ARA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约1. 5%或更少、约或更少、约0. 5%或更少、约0. 2%或更少、或约0. 或更少重量的ARA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分几乎没有ARA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与ARA的重量比为至少约20 1、至少约30 1、至少约35 1、至少约 40 1、至少约60 1、至少约80 1、至少约100 1、至少约150 1、至少约200 1、 至少约250 1、或至少约300 1。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分) 和其组合的一个或多个组分包括约0. 5%-约1%、约0.5%-约2%、约0.5%-约2.5%、约 0. 5% -约 3%、约 0.5% -约 3.5%、约 0.5% -约 5%、约 0.5% -约 6%、约 -约 2%、 约 2% -约 3%、约 2% -约 3. 5%、约 -约 2. 5%、约 -约 3%、约 -约 3. 5%、约 -约5%、或约-约6%重量的DPA n-6。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约6%或更少、约5%或更少、约3%或更少、 约2. 5%或更少、约2%或更少、约或更少、或约0.5%或更少重量的DPA n_6。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分几乎没有DPA n-6。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与DPA n-6的重量比大于约6 1，至少约8 1、至少约10 1、至少约15 1、至少约20 1、至少约25 1、至少约50 1、或至少约100 1。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、留醇组分、甘油二酯组分、 极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括各自占约5%或更少、约4%或更少、约3 %或更少、约2 %或更少、约1. 5 %或更少、约1 %或更少、或约0. 5 %或更少重量的亚油酸(18:2 n-6)、亚麻酸(18:3 n_3)、二十烯酸QO:1 n_9)和芥酸02:1 n_9)。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自留醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约5%或更少、约4 %或更少、约3 %或更少、约2 %或更少、约1. 5 %或更少、约1 %或更少重量的十七酸(17:0)。在一些实施方式中，所述微生物油和/或其一个或多个组分包括约0.01%-约 5%、约0. 05% -约3%、或约0. -约重量的十七酸。
所述甘油三酯分子包含3个中心碳原子((^331-(^332-(^3 ! )，可形成不同的位置异构体。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约20%、至少约30%、至少约35%、或至少约40%的甘油三酯在该甘油三酯内两个位置(选自sn-l、sn-2和sn-3位置中的任意两个)上含有DHA(双取代DHA)，这是基于HPLC 色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约20 % -约40 %、约20 % -约；35 %、约30 % -约40 %、或约30 % -约 35%的甘油三酯在该甘油三酯内两个位置(选自sn-1、sn-2或sn-3位置中的任意两个) 上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约5%、至少约10%、至少约15%、或至少约 20 %的甘油三酯在所有sn-1、sn-2和sn-3位置上含有DHA (三取代DHA)，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约5% -约20%、约5% -约15%、约10% -约20%、或约10% -约15% 的甘油三酯在所有sn-l、Sn-2和sn-3位置上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。相反，美国专利第6，582，941号报道的TAG物质在所有3个位置上不含DHA。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约50%、至少约 55 %、至少约60 %、至少约65 %、至少约70 %、或至少约75 %的甘油三酯在甘油三酯内选自任一 sn-1、sn-2或sn-3位置的一个位置上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约 50% -约 75%、约 50% -约 70%、约 50% -约 65%、约 60% -约 75%、约 60% -约 70%、 或约60% -约65%的甘油三酯在甘油三酯内选自任一 sn-1、sn-2和sn-3位置的一个位置上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。
组合物
本发明还涉及含有本发明破囊壶菌、本发明分离生物质、本发明微生物油、或其组合的组合物。
本发明的破囊壶菌、生物质或微生物油可通过任何已知技术根据组合物需求而进行进一步化学或物理修饰或加工。
破囊壶菌细胞或生物质可在用于组合物前干燥，方法包括但不限于冷冻干燥、空气干燥、喷雾干燥、隧道干燥、真空干燥(冻干)或类似方法。或者，生物质经收获和清洗后能直接用于组合物而不需干燥。参见美国专利第5，130，242和6，812，009号。
本发明的微生物油可用作起始材料以更有效生成富含脂肪酸如DHA的产物。例如，可对本发明的微生物油应用本领域已知的不同纯化技术如蒸馏或尿素加合，以生成具有更高浓度DHA或其他脂肪酸的更高效产物。本发明的微生物油也可用于化学反应以生成所述油中脂肪酸的衍生化合物，如DHA或其他脂肪酸的酯和盐。
本发明的组合物可包括一种或多种赋形剂。本文使用的“赋形剂”指用于本发明组合物以使该组合物具有理想特征的成分或成分的混合物，该组合物包括食物以及药物、 化妆品和工业组合物。本发明的赋形剂加入药物组合物时可描述为“药学上可接受”的赋形剂，意味着所述赋形剂是在全面医学判断范围内以相应合理益处/风险比在所需接触持续期间适于接触人和动物组织而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题性并发症的化合物、物质、组合物、盐和/或剂型。在一些实施方式中，术语“药学上可接受”指联邦或州政府监管机构批准或者美国药典(U. S. Pharmacopeia)或其他国际公认药典中列出用于动物， 更具体是人。可使用不同的赋形剂。在一些实施方式中，所述赋形剂可以是但不限于碱性齐U、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、分离剂、涂层剂、外相成分、控释成分、溶剂、表面活性剂、湿润齐IJ、缓冲剂、填充剂、软化剂、或其组合。除了本文所讨论之外，赋形剂可包括但不限于《雷明顿药学科学和实践》(Remington :The Science and Practice of Pharmacy)第 21 版， (2005)所列。本文中将赋形剂纳入具体分类(例如“溶剂”)用于阐明而不是限制赋形剂作用。一种具体赋形剂可处于多个类别内。
本发明的组合物包括但不限于食品、药物组合物、化妆品和工业组合物。
在一些实施方式中，所述组合物是食品。食品是动物或人消耗的任何食物，且包括固体和液体组合物。食品可以是动物或人食物的添加剂。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包括牛奶、饮料、治疗性饮品和营养素饮料；功能性食品；补充品；保健营养品；婴
16儿配方，包括早产儿配方；怀孕或哺乳期妇女食品；成人食品；老年食品；和动物饲料。
在一些实施方式中，本发明的破囊壶菌、生物质或微生物油可直接使用或作为以下一种或多种中的添加剂油、起酥油、涂抹食品、其他脂肪成分、饮料、调味汁、奶制或豆制品(如牛奶、酸乳、奶酪和冰淇凌)、烤焙物、营养品，例如作为营养补充品(以胶囊或片剂形式)、维生素补充物、膳食补充剂、粉末冲泡饮品、成品或半成品粉末食品、和其组合。
含本发明微生物油的食物组合物的部分列表包括但不限于豆制品(牛奶、冰淇凌、酸乳、饮品、奶油、涂抹食品、增白剂)；汤和汤混合物；面团、糊状物和烘培食物，包括例如精致烘培制品、早餐谷物、蛋糕、芝士蛋糕、馅饼、纸杯蛋糕、曲奇、条状食物、面包、花卷蛋糕、饼干、松饼、酥皮糕点、司康、油煎面包块、薄脆饼干、甜食、甜品小食、派、格兰诺拉麦片/ 小食条和烤吐司；糖果；硬糖果；巧克力和其他糖果；口香糖；液体食品，例如牛奶、能量饮料、婴儿配方、碳酸饮料、茶、流质食物、果汁、果汁饮料、蔬菜汁饮料；复合维生素糖浆、餐食替代物、药膳和糖浆；粉末冲泡饮料混合物；意大利面；加工鱼制品；加工肉制品；加工禽制品；肉汁和调味汁；调味品(蕃茄酱、蛋黄酱等)；植物油涂抹食品；奶制品；酸乳；黄油；冷冻奶制品；冰淇淋；速冻甜食；冻酸奶；半固体食品如婴儿食品；布丁和果冻；加工和未加工奶酪；煎饼混合物；食物条，包括能量条；华夫格混合物；沙拉酱；鸡蛋替代混合物；坚果和坚果涂抹食品；咸味休闲食品如薯片、和其他片或脆片、玉米片、墨西哥玉米片、膨化休闲食品、爆米花、椒盐卷饼、薯条和坚果；特色小吃如调味汁、干果小吃、肉类零食、猪肉皮、健康食物条和年糕/玉米饼。
在一些实施方式中，本发明的微生物油可用于补充婴儿配方。本发明的微生物油可单独或与产生花生四烯酸(ARA)的微生物衍生的身体精油组合来补充婴儿配方。产生ARA的微生物是例如高山被孢霉(Mortierella alpina)或舒克里被孢霉(Mortierella sect, schmuckeri)。或者，婴儿配方可添加本发明微生物油与富含ARA的油，包括ARASC0 (马泰克生物科学公司(Martek Biosciences)，马里兰州哥伦比亚)的组合。
在一些实施方式中，所述组合物是动物饲料。“动物”指属于动物界的任何非人生物，包括但不限于水生和陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食物”指用于非人动物的任何食物，无论是鱼；经济鱼类；观赏鱼；仔鱼；双壳类；软体动物；甲壳动物；贝类；虾；幼虾； 卤虫；轮虫；盐水虾；滤食动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；家畜；耕畜；动物园动物； 运动类动物；种畜；比赛类动物；表演类动物；活化石动物(heirloom animals)；稀有或濒危动物；伴侣动物；宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类动物如猴(例如卷尾猴、 恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猕猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和虎；马科动物如马、驴子和斑马；食用动物如奶牛、牛、猪和羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于水产养殖饲料、家畜饲料，包括宠物饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、畜牲饲料或其组合。
在一些实施方式中，所述组合物是人可消耗其肉或制品的任何动物的饲料或饲料补充品，如从其获得肉、蛋或乳汁可为人食用的任何动物。喂养这些动物时，可将营养素如 LC-PUFA掺入该动物的肉、乳汁、蛋或其他产品以增加这些营养素的含量。
在一些实施方式中，所述组合物是喷雾干燥物质，其可压碎以形成适当大小的颗粒用于浮游动物、卤虫、轮虫和滤食动物消耗。在一些实施方式中，喂以所述组合物的浮游动物、卤虫或轮虫随之被仔鱼、鱼、贝类、双壳类或甲壳动物吃掉。
在一些实施方式中，所述组合物是药物组合物。合适的药物组合物包括但不限于抗炎组合物、冠心病治疗药物、动脉硬化治疗药物、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌药物、神经退行性疾病治疗药物、退行性肝病治疗药物、抗生素、降胆固醇组合物和降甘油三酯组合物。在一些实施方式中，所述组合物是医疗食品。 医疗食品包括在医师指导下使用或外部给予的组合物中的食物和用于某一病症的特定饮食控制的食物，其独特营养需求基于公认的科学原理通过医学评估确定。
在一些实施方式中，所述微生物油可制成剂型。剂型可包括但不限于片剂、胶囊、 囊片、丹剂、丸剂、散剂和颗粒剂、胃肠外剂型，胃肠外剂型包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂和粉末剂，其含有有效量的所述微生物油。本领域也已知这些制剂还可包含药学上可接受稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性运载体、水溶性运载体、乳化齐 、缓冲剂、湿润剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等。给予形式可包括但不限于片剂、糖衣丸、 胶囊、囊片和丸剂，其含有所述微生物油和一种或多种药学上可接受的适当载体。
对于口服给药，所述微生物油可与本领域熟知的药学上可接受载体联用。这类载体能使本发明的微生物油制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬剂等， 以便待治疗个体口服摄入。在一些实施方式中，所述剂型是片剂、丸剂或囊片。获得口服药物制品可通过加入固体赋形剂，任选研磨所得混合物，如需要在加入适当辅剂后加工颗粒混合物，从而获得片剂或糖衣丸芯体。合适的赋形剂包括但不限于填充剂如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制品例如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、 土豆淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如需要，可加入崩解剂，例如但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。能口服使用的药物制品包括但不限于由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊， 以及由明胶和塑化剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。
在一些实施方式中，所述组合物是化妆品。化妆品包括但不限于乳液、乳霜、洗液、 面膜、肥皂、洗发水、化妆水、面霜、护发素、彩妆用品、沐浴基和分散液。化妆试剂可以是医用或非医用。
在一些实施方式中，所述组合物是工业组合物。在一些实施方式中，所述组合物是一种或多种产品的原材料。产品包括但不限于聚合物；照相感光材料；去垢剂；工业用油； 或工业清洁剂。例如，美国专利第7，259，006号描述了使用含DHA的脂肪和油生成山嵛酸和用山嵛酸生产照相感光材料。
使用组合物的方法
在一些实施方式中，所述组合物能用于治疗人或动物中的某一病症。
术语“处理”和“治疗”指治疗性治疗和预防或防止性措施，其中目标是防止或缓解 (减轻)不需要的生理状况、疾病或失调，或是获得有益或需要的临床结果。对于本发明目的，有益或需要的临床结果包括但不限于缓解与某一病症、疾病或失调相关的症状或征兆； 减轻某一病症、疾病或失调的程度；稳定某一病症、疾病或失调(即其中所述病症、疾病或失调不恶化)；延迟所述病症、疾病或失调的发生或进展；改善所述病症、疾病或失调；缓和 (无论组分或全部且无论能检测或不能检测)所述病症、疾病或失调；或者改良或改进某一病症、疾病或失调。治疗也包括与若不接受治疗的预期存活期相比，延长存活期。[0090]在一些实施方式中，用所述组合物治疗某一病症、疾病或失调，如痤疮、急性炎症、 年龄相关性黄斑部病变、变态反应、阿尔茨海默病、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫病、血脂异常、乳腺囊肿、恶病质、癌症、心脏再狭窄、心血管疾病、慢性炎症、冠心病、囊性纤维化、退行性肝病、糖尿病、湿疹、肠胃失调、心脏病、高甘油三酯水平、高血压、多动症、免疫疾病、抑制肿瘤生长、炎症病症、肠失调、肾功能障碍、白血病、重郁症、多发性硬化症、神经退化性疾病、骨关节炎、骨质疏松症、过氧化物酶体异常、子痫前期、早产、银屑病、肺异常性类风湿关节炎、心脏病风险或血栓。
在一些实施方式中，所述组合物用于增加妊娠最后三个月的妊娠期长度。
在一些实施方式中，所述组合物用于控制血压。
在一些实施方式中，所述组合物用于改善或维持认知功能。
在一些实施方式中，所述组合物用于改善或维持记忆。
所述组合物或剂型可通过任何与该组合物或剂型相容的途径给予对象体内。如果某一物质由对象引入其体内，或如另一人、机器或装置将该物质引入对象体内，则认为“给予”了该物质。因此，“给予”包括自身给予、通过其他方式给予和间接给予。本文涉及“给予”使用的术语“持续”或“连续”指给予频率为至少每天一次。然而，应注意给予频率可以大于每天一次且仍为“持续”或“连续”，例如每天二次或甚至三次，只要不超过本文指定的剂量水平。给予的方式和方法在本领域已知且技术人员可参考不同的药理学参考文献用于指导。例如，可查阅“现代药剂学”(Modern Pharmaceutics), Banker和Rhodes，美国健康信息Gnforma Healthcare)，第4版(2002)和“Goodman & Gilman的《治疗学的药学基石出》，，(Goodman & Gilman' s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics),纽约的麦克劳希尔有限公司(McGraw-Hill Companies, Inc.)，第 10 版(2001)。
“对象”、“个体”或“患者”指需要诊断、预后或治疗的任何对象，无论是人或非人。 哺乳动物对象包括但不限于人；家畜；耕畜；动物园动物；运动类动物；宠物如狗、猫、豚鼠、 兔、大鼠、小鼠、或马；灵长类动物如猴(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猕猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和虎； 马科动物如马、驴子和斑马；食用动物如奶牛、牛、猪和羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。术语对象也涵盖模型动物，例如疾病模型动物。在一些实施方式中，术语对象包括经济上或其他方面有价值的动物，例如经济上重要的种畜、比赛类动物、表演类动物、活化石动物、稀有或濒危动物、或伴侣动物。在一些实施方式中，对象是人对象。在某些实施方式中，对象是非人对象。
所述组合物可以“治疗有效量”、“预防有效量”、“治疗剂量”、或“预防剂量”给予。 “治疗有效量”或“治疗剂量”指在必要的剂量和时间段内有效获得所需治疗结果的量。治疗结果可以是例如减轻症状、延长存活、改善移动性等。治疗结果不必是“治愈”。“预防有效量”或“预防剂量”指在必要的剂量和时间段内有效获得所需预防结果的量。通常，由于预防剂量在疾病早期之前或期间用于对象，预防有效量小于疾病晚期治疗的治疗有效量。
根据待给予对象的破囊壶菌、生物质或微生物油的DHA或其他脂肪酸成分的量， 可将不同剂量的药物组合物给予对象。术语“日剂量”、“日剂量水平”、“每日剂量”在本文中指每天(每M小时段)给予的DHA或其他脂肪酸成分总量。因此，例如给予对象aiig DHA 的日剂量意味着该对象每天接受共ang DHA，无论DHA以含aiig DHA的单个剂型或是以各
19含0. 5mg DHA的四个剂型(总共^iig DHA)给予。在一些实施方式中，每日DHA量以单个剂型或两个剂型给予。本发明的剂型可一次施用或多次施用。例如，若每日用4片，每片含 0. 5mg DHA，则可每天一次服用所有4片，或每天两次2片，或每6小时1片。在一些实施方式中，日剂量为约IOOmg-约15g DHA。在一些实施方式中，日剂量为约IOOmg-约250mg、 约 IOOmg-约 500mg、约 IOOmg-约 lg、约 Ig-约 2. 5g、约 Ig-约 5g、约 Ig-约 10g、约 Ig-约 15g、约 5g-约 10g、约 5g-约 15g、约 IOg-约 15g、约 IOOmg-约 10g、约 IOOmg-约 5g、或约 IOOmg-约 2. 5g。
可用不同方案给予本发明的组合物或剂型。例如，在一些实施方式中，连续数天每日给予，或者每隔一天(每两天)给予。可以在一天或多天给予。
给予所述组合物和剂型可与治疗所述病症的其他方案联用。例如，本发明的方法可与膳食方案(例如低糖饮食、高蛋白饮食、高纤维饮食等)、锻炼方案、减肥方案、戒烟方案或其组合联用。本发明的方法也可与其他药品联合治疗所述病症。本发明的组合物或剂型可在其他方案或药品之前或之后给予。
含组合物的药盒
本发明还涉及含一个或多个单位的本发明组合物的药盒或包装。药盒或包装可包括数单位的食品、药物组合物、化妆品或工业组合物，其含有本发明的破囊壶菌、生物质或微生物油、或其组合。药盒或包装也可包括含本发明破囊壶菌、生物质或微生物油、或其组合的添加剂，用于制备食品、化妆品、药物组合物或工业组合物。
在一些实施方式中，所述药盒或包装含有根据本发明方法给予的一个或多个单位的药物组合物。所述药盒或包装可含有一剂量单位，或大于一剂量单位(即多剂量单位)。 如果所述药盒或包装中存在多剂量单位，可任选安排该多剂量单位以依序给予。
本发明的药盒可任选包含与该药盒的单位或剂型相关的说明。这类说明可以是政府监管药品生产、使用或销售的机构规定的形式，这反映其被生产、使用或销售监管机构批准用于人给药以治疗某一病症或失调。所述说明可以是传递根据本发明方法使用药盒中单位或剂型的信息的任何形式。例如，所述说明可以是印刷品，或是预录制媒体装置形式。
在检查病人过程中，医学专业人员可确定施用本发明的一种方法是适合该病人的，或医师可确定通过施用本发明方法的一种方法能改善病人病症。开出任何方案前，医师可告知病人例如与该方案相关的不同风险和益处。充分告知病人与该方案相关的所有已知和疑似风险。这类提示可以是口头以及书面形式。在一些实施方式中，医师可提供关于该方案的文献资料给病人，例如产品信息、教材等。
本发明也涉及教育消费者了解治疗方式的方法，该方法包括在销售点分发剂型与消费者信息。在一些实施方式中，分发在具有药剂师或医疗服务提供者的销售点进行。
术语“消费者信息”可包括但不限于英语文本、非英语文本、视觉图像、图表、电话录音、网址、客服代表联系方式。在一些实施方式中，消费者信息提供指南用于根据本发明方法使用剂型、合适使用年龄、提示、禁忌、合适剂量、警告、网址的电话。在一些实施方式中，本方法还包括提供专业信息给某一地点的相关人员，以回答消费者关于根据本发明方法使用所述方案的问题。术语“专业信息”包括但不限于涉及根据本发明方法给予时方案的信息，信息设计成能使医学专业人员回答消费者问题的形式。
“医学专业人员”包括例如医师、医师助理、执业护士、药剂师和客服代表。[0109]总体上描述本发明后，可参考本文提供的实施例进一步加以理解。这些实施例仅用阐明且不用于限制。
实施例1
鉴定以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌以便分类。
在低潮期从潮间带生境中收集样品。将水、沉淀物、活植物物质和腐败植物/动物残骸置于50ml无菌管。各样品组分与水一起平铺于分离培养基的固体琼脂板上。分离培养基由以下组成500ml人工海水、500ml蒸馏水、Ig葡萄糖、Ig甘油、13g琼脂、Ig谷氨酸盐、0. 5g酵母膏、0. 5g酪蛋白水解物、Iml维生素溶液(100mg/L硫胺素，0. 5mg/L生物素， 0. 5mgB12)、lml 痕量矿物质溶液(PII 金属，每升含有:6. Og FeCl36H20，6. 84g H3BO3,0. 86g MnCl24H20，0. 06g ZnCl2,0. 026 CoC126H20,0. 052g NiSO4H20,0. 002g CuS045H20 和 0. 005g Na2Mo042H20)和各500mg的青霉素G和硫酸链霉素。琼脂板避光20-25 °C孵育。2_4天后， 琼脂板放大后加以检测，用无菌牙签挑出细胞菌落并重划线培养于新鲜培养基板。细胞重复划线培养于新鲜培养基上，直到去除污染生物。
将来自琼脂板的菌落转移到皮氏培养皿中，所述培养皿具有半皿海水和Iml高压灭菌的新孵化盐水虾幼虫悬浮液。2-3天后盐水虾幼虫严重过度生长，产生孢子囊簇。释放的游动孢子在排出时具有双鞭毛，活跃地游离成熟孢子囊，孢子释放后其在壁上的残留物清晰可见(相位差)。测得孢子囊直径为12. 5 μ m-25 μ m,游动孢子大小为2. 5 μ m-2. 8ym χ 4. 5 μ m-4. 8 μ m。各单独孢子囊有8- 个孢子。沉淀的游动孢子放大并迅速经历二分裂， 产生四分体、八分体并最终形成孢子囊簇。四分体形成在孢子囊成熟前较早期开始。这些特征与裂殖壶菌属一致。
基于其18s rRNA基因与已知物种的相似性，进一步鉴定以ATCC登录号PTA-9695 保藏的分离破囊壶菌。以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的总基因组DNA通过标准方法制备(Sambrook J.和Russell D. 2001.《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，第 3 版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory I^ress)，纽约冷泉港)并用于PCR扩增18s rRNA基因。用前述引物完成该18s rRNA基因的 PCR 扩增(Honda 等，J. Eukaryot. Microbiol. 46 (6) 1999)。用染色体 DNA 摸板的 PCR 条件如下0. 2μ M dNTPs，0. IuM 各引物，8% DMS0，200ng 染色体 DNA，2. 5U PfuUltra II 融合HS DNA聚合酶(司查塔基公司(Stratagene))和IX PfuUltra 缓冲剂(司查塔基公司)，50yL总体积。PCR操作包括以下步骤(1)95°C 2分钟；(2)95°C 45秒；(3)55°C 30 秒；(4) 720C 2分钟；(5)重复步骤2-4，40轮；(6) 72°C 5分钟；和(7)保持于6°C。
用上述染色体模板的PCR扩增产生具有预期大小的独特DNA产物。根据厂商说明将所述PCR产物克隆到pJET1.2/钝端(i^rmentas)载体中，用提供的标准引物确定插入序列。
表2显示以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的18s rRNA序列与国家生物技术信息中心(NCBI)电子数据库中DNA序列的比对。简要地，通过VectorNTI程序(英杰公司(Invitrogen))的“AlignX“程序内评分矩阵“swgapdnamt “( 一种DNA比对标准) 测定“相同性％”。从NCBI电子数据库的基本局部比对搜索工具(BLAST)计算结果获得“覆盖％ ”，“覆盖％ ”是比对区段内含有的查询长度的百分数。
表2 18s rRNA序列的比较[0118]
权利要求
1.一种以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
2.一种具有以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌特征的分离破囊壶菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
3.一种含有甘油三酯组分的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸 n-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
4.一种与以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌同种的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。
5.如权利要求
1到4中任一项所述的分离破囊壶菌微生物，其特征在于，所述衍生菌株是突变菌株。
6.一种以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离的破囊壶菌微生物。
7.一种以ATCC登录号PTA-9696保藏的分离的破囊壶菌微生物。
8.一种以ATCC登录号PTA-9697保藏的分离的破囊壶菌微生物。
9.一种以ATCC登录号PTA-9698保藏的分离的破囊壶菌微生物。
10.一种含有前述权利要求
中任一项所述的破囊壶菌微生物或其混合物的破囊壶菌生物质。
11.一种分离的破囊壶菌生物质，其中，至少约50重量％的所述生物质的细胞干重是脂肪酸，且其中至少约50重量％的脂肪酸是Ω -3脂肪酸。
12.如权利要求
11所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，所述至少约50重量％的所述脂肪酸是二十二碳六烯酸。
13.一种分离的破囊壶菌生物质，其中，至少约25重量％的所述生物质的细胞干重是二十二碳六烯酸。
14.如权利要求
10到13中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，约10重量％或更少的所述脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中二十二碳六烯酸与二十碳五烯酸的重量比为至少约5 1。
15.如权利要求
10到14中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，约1.5重量％或更少的所述脂肪酸是花生四烯酸，且其中二十二碳六烯酸与花生四烯酸的重量比为至少约20 1。
16.如权利要求
10到15中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，所述生物质还含有重量比为至少约10 1的二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6。
17.一种含有权利要求
1到9中任一项所述的破囊壶菌微生物或其混合物的分离破囊壶菌培养物。
18.如权利要求
17所述的分离破囊壶菌培养物，其特征在于，所述破囊壶菌培养物还包括至少约5%的溶解氧。
19.一种用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包括权利要求
1到16中任一项所述的破囊壶菌微生物或破囊壶菌生物质或其混合物。
20.一种含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中，所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约50重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为约0.5重量％ -约6重量％。
21.如权利要求
20所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油中所述甘油三酯组分的花生四烯酸含量为约1. 5重量％或更少。
22.—种含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中，所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比例为大于约6 1。
23.一种含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中，所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约60重量％。
24.如权利要求
20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述甘油三酯组分的至少约20 %甘油三酯在所述甘油三酯内的两个位置上含有二十二碳六烯酸，所述位置选自 sn-U sn-2和sn-3位置中的任意两个。
25.如权利要求
20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述甘油三酯组分的至少约5%甘油三酯在所述甘油三酯中sn-1、sn-2和sn-3三个位置上都含有二十二碳六烯酸。
26.如权利要求
20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油还包括约5重量％或更少的十七酸。
27.一种用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包括权利要求
20到沈中任一项所述的微生物油。
28.如权利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是婴儿配方。
29.如权利要求
观所述的食品，其特征在于，所述婴儿配方适合早产儿。
30.如权利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、 营养素饮料或其组合。
31.如权利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。
32.如权利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是营养补充品。
33.如权利要求
19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是动物饲料。
34.如权利要求
33所述的动物饲料，其特征在于，所述动物饲料是水产养殖饲料。
35.如权利要求
33所述的动物饲料，其特征在于，所述动物饲料是牲畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、家畜饲料或其组合。
36.一种含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，所述方法包括(a)使权利要求
1到9中任一项所述的分离破囊壶菌微生物或其混合物在培养物中生长以生成生物质，和(b)从所述生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。
37.如权利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培养物包括至少约5%的溶解氧。
38.如权利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培养物pH维持在约6.5-约8. 5。
39.如权利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培养物温度维持在约17°C-约30°C。
40.如权利要求
36所述的方法，其特征在于，所述培养物包括约5g/L-约50g/L浓度的葡萄糖。
41.一种含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，所述方法包括从权利要求
10到16中任一项所述的生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。
42.如权利要求
41所述的方法，其特征在于，所述含Ω-3脂肪酸的微生物油用己烷提取方法提取。
43.如权利要求
41所述的方法，其特征在于，所述含Ω-3脂肪酸的微生物油用无溶剂提取方法提取。
44.如权利要求
36到43中任一项所述的方法或者权利要求
17或18所述的分离破囊壶菌培养物，其特征在于，所述从每升培养物中分离的生物质细胞干重在PH约6. 5-约8. 0 的培养基中约17°C -约30°C生长约7天后为至少约50g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。
45.如权利要求
36到43中任一项所述的方法或者权利要求
17或18所述的分离破囊壶菌培养物，其特征在于，所述Ω -3脂肪酸生产率在ρΗ约6. 5-约8. 0的培养基中约17°C -约 30°C生长约7天后为至少约2克/升/天，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约 8500ppm氯离子。
46.一种通过权利要求
36到45中任一项所述的方法产生的微生物油。
47.权利要求
1到16、20到沈、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物在生产治疗炎症或其相关病症的药物中的应用。
48.权利要求
1到16、20到沈、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物在治疗炎症或其相关病症中的应用。
49.如权利要求
1到16、20到沈、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物，用于治疗炎症或其相关病症。
50.一种在需要的对象中治疗炎症或其相关病症的方法，所述方法包括将权利要求
1 到16、20到沈、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物以及药学上可接受载体给予对象。
专利摘要
本发明涉及分离的破囊壶菌微生物以及其菌株和突变体。本发明还涉及生物质、微生物油、组合物、培养物、生成微生物油的方法、和使用分离破囊壶菌、生物质及微生物油的方法。
文档编号C12N15/82GKCN102428185SQ200980159422
公开日2012年4月25日 申请日期2009年3月19日
发明者J·M·汉森, J·W·普菲弗三世, K·E·阿普特, P·W·伯赫恩斯, R·泽克尔, T·L·斯托尔 申请人:马太克生物科学公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan