从形质转化蚕茧提取的荧光丝蛋白质溶液的制备方法及利用其的载体制备方法与流程

本发明涉及添加了还原剂的荧光丝蛋白质制备方法，更详细地，涉及一种用于利用还原剂在使形质转化蚕茧保持荧光的同时获得大量蛋白质的荧光丝蛋白质制备方法及利用其的载体制备及应用。

背景技术：

丝纤蛋白（silkfibroin）是从蚕提取并制备的典型的天然高分子物质，长期以来一直用作织物的纤维材料及诸如缝合线的医疗工程学材料。当丝纤蛋白应用于活体时，几乎不引起炎症反应，且对成纤维细胞或角质细胞等的细胞附着能力和增殖效果出色，从而作为活体适合性优秀的人工皮肤的材料受到大量关注。另外，不同于其它的天然高分子材料，丝纤蛋白可以通过昆虫而容易地大量获得纯蛋白质，活体适合性优秀，从而即使不经过特别的精制过程，也几乎不出现对人体的排异反应，具有可以成型为粉末、膜、多孔质体及凝胶等各种形态的特征。

绿色荧光蛋白质（greenfluorescentprotein,gfp）由日本海洋生活学者下村修于1962年在研究水母（aequoreavictoria）的荧光物质的过程中首次发现，1969年被hasting和morin命名为绿色荧光蛋白质。gfp在活体内作为搬运被钙激活的发光蛋白质（photoprotein）或荧光素酶-氧化荧光素复合体的能量的能量传递受体进行作用，从水母素（aequorin）接受能量，作为释放508nm的绿色荧光的2次荧光蛋白质而进行作用。当在细胞中存在对该gfp进行编码的dna或mrna时，gfp蛋白质在细胞内合成而发出强烈的荧光。如果将对gfp进行编码的序列连接于想要调查表达程度的基因，则使得gfp在希望实际调查的基因进行表达的场所表达荧光，因此在调查基因表达方面大量使用。特别是由于观察容易、不具毒性的优点，在基因表达的有无、场所、时间测量等各种的领域使用。还开发了与其功能上类似的黄荧光蛋白质（yfp）、青绿色荧光蛋白质（cfp），此外，还制成有红色、黄色等各种颜色的荧光蛋白质。如此各种的荧光蛋白质在要一次性获知多个蛋白质的地区分布时被有效地使用。

形质转化蚕是将北美产水母的绿色荧光基因插入作为茧丝（从蚕茧抽取的丝）主成分的丝心蛋白（fibroin构成蚕茧纤维的纤维蛋白质）基因后，将其利用微细注射装置注入蚕卵而形成。该蚕是形质转化非常困难的实用品种。相比于从日本开发的多化性（一年多次孵化的性质）品种为对象的形质转化蚕，能够生产3倍以上的绿色荧光丝。特别是在将基因注入蚕卵时，确保指明最佳微细注射位置的独创性核心技术，使形质转化效率提高平均为42.5%，提高最大为75%，远远高于日本10%左右的形质转化效率。从形质转化蚕中提取的绿色荧光丝，如果照射特定波长的光，则在黑暗中显示绚丽的绿色荧光，即使在自然光下，也带有淡绿色。再者，与用于丝生产的精炼过程中颜色消失的彩色茧或黄金茧不同，即使进行精炼，保持依然的绿色荧光。绿色荧光基因传递至下一代。因此，无需另外的染色处理，便可以用作时装、壁纸、灯罩、饰品、装潢用品等的材料。

用于制作荧光丝纤蛋白载体的溶液，以现有制备方法无法保持荧光。绿色荧光蛋白质（gfp）与强盐反应的情况下失去荧光。因此，就现有丝纤蛋白溶液而言，作为制备方法，在将通过精炼而获得的丝纤蛋白纤维制备成溶液的过程中，利用作为强盐的9.5m的libr水溶液进行溶解，因而难以保持gfp的荧光。另外，不同于现有b.mori，无法很好地溶于9.5mlibr水溶液，在溶液制备方面存在限制。

技术实现要素：

技术课题

为了解决所述问题，本发明为了利用荧光蚕茧在保持荧光的同时制备溶液并制备利用其的载体而进行研究的结果，发明了添加还原剂的制备方法。

技术方案

因此，本发明提供一种制备荧光丝纤蛋白溶液的方法，其特征在于，包括：a）将荧光蚕茧放入包含精炼剂的水溶液中，在8-24小时期间加热到40-60℃后，用蒸馏水清洗而获得精炼的荧光丝纤蛋白的步骤；b）在每9-9.6mlibr100ml混合有二硫苏糖醇（dithiothreitol,dtt）15mg-1.5g的溶剂中，在40-60℃下溶解所述精炼的荧光丝纤蛋白1-5小时的步骤；及c）在一次蒸馏水中透析所述溶解的荧光丝纤蛋白48-96小时的步骤。优选地，所述精炼剂包含碱性蛋白酶（alcalase）及碳酸氢钠（nahco3）。

本发明还提供一种组织再生用载体，所述组织再生用载体包含以所述制备方法制备的荧光丝纤蛋白溶液。

本发明还提供一种生物成像用组合物，生物成像用组合物包含以所述制备方法制备的荧光丝纤蛋白溶液。

发明效果

对于荧光蚕茧，利用现有丝纤蛋白溶液制备方法，存在在低温下不能溶解丝纤蛋白、失去荧光的缺点。但本发明的添加还原剂的方式具有能够在低温下制备荧光丝纤蛋白溶液，且保持荧光的优点。因此，根据本发明，能够实现荧光丝纤蛋白的大量生产，能够容易地制备、提供活体适合荧光蛋白质，因而可以提供能够应用于组织再生用载体、通过生物成像（bioimaging）和生物芯片（biochip）的生物传感器等生物产业的材料。另外，根据本发明，可以从基因变异蚕茧获得大量荧光丝纤蛋白，且能够制作成多种所需形态，无细胞毒性，从而能够替代用作适合活体的活体材料。另外，当制作成荧光丝物质时，不失去荧光，因而不仅是医疗，还能够为要求荧光的生物医学做出巨大贡献。

附图说明

图1是荧光丝纤蛋白溶液制备方法。

图2是通过sds-page的荧光丝纤蛋白分子量确认结果。

图3是荧光丝纤蛋白溶液的荧光确认结果。

图4是利用共焦显微镜（confocalmicroscopy）观察的荧光丝纤蛋白膜的荧光和细胞增殖（cellproliferation）结果。

图5是在荧光丝纤蛋白膜中培养的细胞毒性实验结果。

图6是利用扫描电子显微镜（sem,scanningelectronmicroscope）和共焦显微镜（confocalmicroscopy）观察的荧光丝纤蛋白纳米膜。

图7是将荧光丝纤蛋白载体插入于动物后观察的图像。

图8是插入荧光丝纤蛋白载体的动物的组织图像。

图9是将小鼠食道穿孔利用荧光丝纤蛋白质跟踪的跟踪图像。

图10是对在胃（stomach）内吸收的荧光蛋白质的组织图像。（a：对照组，b：egfp-sf）

图11是利用荧光丝纤蛋白标记的p53抗体来观察癌细胞中的p53表达的图像。

具体实施方式

本发明提供对荧光蚕茧添加还原剂而制备保持荧光的活体适合性荧光蛋白质及应用载体的方法。根据本发明，可以从少量的形质转化荧光蚕茧生产大量的荧光丝素蛋白质。

本发明的荧光丝纤蛋白溶液的特征在于，包括：a）将荧光蚕茧放入包含精炼剂的水溶液中，在8-24小时期间加热到40-60℃后，用蒸馏水清洗而获得精炼的荧光丝纤蛋白的步骤；b）在每9-9.6mlibr100ml混合有二硫苏糖醇（dithiothreitol,dtt）15mg-1.5g的溶剂中，在40-60℃下溶解所述精炼的荧光丝纤蛋白1-5小时的步骤；及c）在一次蒸馏水中透析所述溶解的荧光丝纤蛋白48-96小时的步骤。优选地，所述精炼剂包含碱性蛋白酶（alcalase）及碳酸氢钠（nahco3）。在所述a）步骤中，如果精炼时间不足8小时，则丝胶蛋白无法完全去除，如果超过24小时，则丝心蛋白会变性。另外，在所述a）步骤中，如果温度不足40℃，则碱性蛋白酶（alcalase）等酶精炼剂无法激活，如果超过60℃，则荧光蛋白质会变性。在所述b）步骤中，如果libr不足9m，则荧光丝纤蛋白蛋白质无法溶解，如果超过9.6m，则libr在常温下无法溶解。另外，在所述b）步骤中，如果二硫苏糖醇不足15mg，则荧光无法表达，如果超过1.5g，则毒性会表达，因而不适合用作活体材料。另外，在所述b）步骤中，如果不足40℃，则荧光丝纤蛋白无法溶解，如果超过60℃，则荧光蛋白质会变性，如果溶解时间不足1小时，则荧光丝纤蛋白无法完全溶解，如果超过5小时，则荧光丝纤蛋白的分子量会降低。在所述c）步骤中，如果荧光丝纤蛋白溶液透析时间不足48小时，则荧光丝纤蛋白溶液的盐没有被去除，如果超过96小时，则丝纤蛋白会变性。

下面通过实施例来说明本发明。但是，这只是为了容易理解发明，不能认为本发明限于此。

[实施例1]

1.荧光丝纤蛋白溶液的制备

如图1所示，在蒸馏水600ml中放入碱性蛋白酶0.9ml和nahco31.8g而制成的精炼水中放入荧光蚕茧20g，以60℃加热12小时后，用蒸馏水反复清洗3次来完成了精炼过程。如此去除丝胶蛋白和杂质等，获得了纯荧光丝纤蛋白纤维15g。对于精炼的荧光丝纤蛋白，用混合有1mm二硫苏糖醇（dithiothreitol（dtt），如果添加dtt15.41mg，则成为1mmdtt，当dtt为1mm以上时表达荧光）的9.5mlibr100ml在40℃下溶解3小时后，在一次蒸馏水中透析72小时，从而制作了4w/w%的纯荧光丝纤蛋白溶液（fluorescentsilkfibroinsolution）200ml（图1）。

2.荧光丝纤蛋白分子量确认

为了分析上述中制备的荧光丝纤蛋白的分子量而执行了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）。sds-page使用微变性蛋白三细胞系统（mini-protean3cellsystem，伯乐公司）。试料准备了4种不同颜色（家蚕丝纤蛋白（b.morisilkfibroin）,egfp（增强型绿色荧光蛋白）,mkate2,eyfp（增强型黄色荧光蛋白））的丝纤蛋白溶液，在10%丙烯酰胺凝胶和4%冷凝凝胶（condensinggel）中进行了处理，蛋白质带用0.25%考马斯亮蓝r-250（西格玛-奥德里奇，美国密苏里州圣路易斯（sigma-aldrich,st.louis,mo,usa））进行染色，从而确认了分子量（图2）。b.morisilkfibroin（泳道（lane）1）拖入在15-250kda范围。egfp（泳道2）、mkate2（泳道3）、eyfp（泳道4）出现在重链约60kda，还可以确认在轻链26kda。

3.荧光丝纤蛋白溶液的荧光确认

使用ls-55（珀金埃尔默圣，美国加利福尼亚州克拉拉（perkinelmer,santaclara,ca,usa））荧光分光光度计，观察制备的4%荧光丝纤蛋白溶液的荧光光谱。众所周知各个荧光蛋白质在488nm（egfp）、514nm（eyfp）和588nm（mkate2）中显示激发（excitation）波长，在507nm（egfp）、527nm（eyfp）和633nm（mkate2）中出现发射（emission）波长。结果，确认了荧光蚕茧的激发（图3-a）和荧光丝纤蛋白溶液的激发（图3-c）相互类似，且与现有荧光蛋白质的波长也类似。荧光蚕茧的发射（图3-b）和荧光丝纤蛋白溶液的发射（图3-d）也相互类似，且与现有发射波长也类似（图3）。因此，确认了从荧光蚕茧制备的荧光丝纤蛋白溶液保持荧光。

[实施例2]

荧光丝纤蛋白膜制作及细胞增殖（cellprliferation）确认

荧光丝纤蛋白膜按如下制作。将制备的荧光丝纤蛋白溶液5～10ml倒入至90×15mm培养皿中，在平均温度26℃的室内干燥48小时。使用直径3mm的活检穿孔器将所述通过干燥制备的各荧光丝纤蛋白膜制成圆形后，在96孔细胞培养板中播种nih3t3成纤维细胞，培养24小时。为了目视观察，利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）、罗丹明标记的鬼笔环肽（rhodaminephalloidin，英杰公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）对细胞进行染色，通过荧光显微镜（eclipse80i,尼康公司，日本）进行了观察。结果可以观察到，荧光丝纤蛋白膜不仅保持了固有的荧光，而且细胞附着度也出色（图4）。另外，为了获知荧光丝纤蛋白膜的细胞亲和性及培养程度，培养1、3、7天后，实施了cck-8试验。结果显示出播种于各载体的细胞数随着时间而逐渐增加的样态。（图5）

因此，确认了本发明的荧光丝纤蛋白即使制备成膜，也没失去荧光，而是保持各自固有的荧光，在细胞培养方面，可以观察到附着良好。

[实施例3]

荧光丝纤蛋白纳米膜制作及确认

荧光丝心蛋白纳米纤维膜按如下制作。将从实施例2制作的荧光丝纤蛋白海绵，以98%甲酸水溶液为溶剂，按6.5%（w/v），在40℃下溶解16小时。将制备的溶液加入至10ml注射器。使流速保持在0.3ml/h，使用22规格注射器尖端（0.7mmod×0.4mmid），注射器尖端与纺丝板的距离（tcd,tiptoc+ollectordistance）为15cm，将注射器尖端设定为+20kv，纺丝板设定为-2kv，使4个注射器纺丝12小时。

为了确认在制作的荧光丝纤蛋白纳米膜的纳米纤维和纤维中是否保持荧光，利用扫描电子显微镜（sem,scanningelectronmicroscope）和共焦显微镜（confocalmicroscopy）进行了确认。查看扫描电子显微镜照片（图6-a,b,c），可以确认，通过静电纺丝可以制作纳米大小的纤维，通过共焦显微镜照片（图6-d,e,f）结果，可以确认保持荧光（图6）。

[实施例4]

利用动物模型的体内荧光图像

1.丝载体的通过活体内插入的生物光子

将制备的荧光丝纤蛋白溶液在-80℃下冷冻12小时后，冷冻干燥24-36小时来制作了荧光丝纤蛋白海绵。将制作的荧光丝纤蛋白海绵插入至动物模型后，确认了活体内荧光图像效果。动物模型使用了无毛小鼠，利用动物荧光成像系统（fluorescenceanimalimagingsystem，ivis200，珀金-埃尔默公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉），确认了体内荧光表达。确认结果可以观察到在各个海绵所在的组织中表达荧光（图7）。另外，取出24小时以内的组织和1年后的组织，通过冷冻超薄切片（cryosection）制作了样本，为了目视观察，利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）、罗丹明标记的鬼笔环肽（英杰公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）对细胞进行染色，通过荧光显微镜（eclipse80i，尼康公司，日本）进行了观察（图8）。结果在24小时（图8-a,b,c）及1年后（图8-d,e,f）的样本中可以观察到，各个载体整个形态和保持荧光的情形。

2.食道穿孔模型

将本研究中制作的荧光丝纤蛋白溶液应用于动物模型，确认是否能够用于生物光子。动物模型是在sd大鼠食道中弄出0.5mm穿孔，并将制作的荧光丝纤蛋白溶液经口给药后，利用荧光显微镜以每0.2秒间隔进行观察。观察结果，随着通过时间，在穿孔部位检测出荧光物质，能够跟踪微细的穿孔部位（图9）。

3.胃（stomach）内吸收的荧光蛋白质组织学观察

将在所述实施例2制作的荧光丝纤蛋白海绵1g对sd大鼠经口给药，观察了在胃内消化吸收的荧光物质。在经口给药荧光丝纤蛋白海绵24小时后，取出了胃组织。作为对照组，向sd大鼠经口给药玉蚕丝海绵1g后，取出了组织。将取出的组织通过冷冻超薄切片（cryosection）制作样本，为了目视观察，利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）对细胞进行染色，通过荧光显微镜（eclipse80i，尼康公司，日本）进行了观察。其结果，在经口投入作为对照组的玉蚕丝海绵的情况下（图10-a），未观察到荧光粒子，但在经口投入本发明的荧光丝纤蛋白海绵的情况下（图10-b），可以观察到在胃粘膜内分布有荧光粒子（图10）。因此，荧光丝纤蛋白粒子在胃酸下不失去荧光，可以用作能够浸透至胃粘膜内部的生物光子活体材料。

4.荧光丝纤蛋白标记的p53抗体制作及利用其的癌细胞中的p53表达确认

在稀释为0.2%的精制荧光丝溶液1ml中，加入nhs-peg4-生物素溶液154.05μl（ez-连接nhs-peg4-生物素化作用试剂盒（ez-linknhs-peg4-biotinylationkit）,赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），在冰上培养4小时后，通过去盐柱，从而制作了生物素化丝（biotinylated-silk）。在该溶液500μl中，掺入p53抗体7μl（抗体浓度1mg/ml）（ahbcoreinc,美国加利福尼亚州拉蒙纳），培养2小时，制作了荧光丝纤蛋白标记的p53抗体。在96孔板中培养海拉（hela）细胞，将制作的抗体按每孔300μl进行处理，24小时后，通过荧光显微镜（eclipse80i，尼康公司，日本）进行了观察（图11）。借助于荧光标记的抗体，可以确认在hela细胞中过度表达的p53基因。