专利名称：细菌自溶物的制作方法
技术领域：
本发明涉及从细菌生物量(biomass)，特别从包含甲烷营养型细菌的细菌培养物生产可口性(palatability)提高的水解产物的方法。特别发现此产物在人和动物食物用作替代传统酵母衍生物的养分或口味(flavour)提高剂。
背景技术：
近来，开发可掺入人和/或动物食用的食物的蛋白质新来源引起了很多注意。若干含蛋白质的不同物质已被建议作为人类食物中更多传统来源的蛋白质，如鱼粉(meal)，大豆(soya)产品和血浆的替代物，并作为动物饲料。这些物质包括含蛋白质微生物(本文也指“单细胞蛋白质”)如真菌，酵母和细菌。
单细胞蛋白质物质可被直接用于食物，例如作为喷射干燥(spray dried)产物，或者所述生物量可在使用前，例如用技术如均一化和/或分离，来进一步处理。例如，WO01/60974公开生产具有优异功能特征的细菌生物量的均一化衍生物的过程，该衍生物可在数种食品制备中用作，例如胶凝剂或乳化剂。
今日，大多广泛应用的单细胞蛋白质衍生自真菌或酵母。例如，众所周知酵母用于酿造，制酒和培烤产业。数种酵母加工衍生物也已知用于制备饲料。例如，酵母自溶(autolysis)产生数种已知的用作食品中调味料(flavouring)或调味品(seasoning)的细胞组分，例如在调味料(sauce)，肉汁(gravies)等的制备过程中。然而，一般需要相对大量的酵母自溶物(autolysate)来获得所需的口感提高的效果。并且，酵母自溶一般缓慢而且需要数天来完成适宜程度的消化。因此一般需要作为自溶引发剂(initiator)或刺激剂(stimulator)的添加剂，例如巯基试剂，来加快所述自溶方法。这增加了商业生产酵母自溶物的成本。
对能增加人和动物食品可口性的替代物质，特别是可以大量生产并且成本相对低的物质的需要是持续的。特别需要能作为口味提高剂的物质。
发明内容
现在我们惊喜发现含甲烷营养型细菌的生物量，或其衍生物(例如匀浆化的衍生物)的自溶作用，具有生产有效的可口性提高组分(特别是口味组分)的效果，该组分也被用作养分，即饲料或饲料组分。
因此，一方面，本发明提供生产饲料或饲料组分，例如可口性提高制剂的方法，所述方法包括使包含甲烷营养型细菌的微生物培养物，或其衍生物(例如匀浆化的衍生物)自溶。通过此方法生产的自溶产物是本发明的另一方面。
本发明生产的自溶产物通常可被用作鱼或贝壳类动物(shellfish)的饲料或饲料组分，例如见PCT/GB02/03795描述(其附件随同递交)其内容引入本文作为参考。类似，所述自溶产物可特别被用作宠物食物，特别是狗食物的口味提高剂，例如见英国专利申请No.0203907.1描述(其附件随同递交)其内容引入本文作为参考。
本发明自溶产物特别优选用作丸状可挤压(extruded)鱼食的组分。所述鱼食丸通常也包含蛋白质和脂质，例如鱼粉和鱼和/或植物油，及少量碳水化合物，例如植物源淀粉。
本文所用术语“自溶”包括用细胞内包含的内源酶，如核酸酶和蛋白酶，消化所述细胞的组分的过程。此“自身-消化”过程导致产生多种细胞的降解产物，包括肽，氨基酸，核苷酸，磷脂，脂肪酸，等等。
本文所用术语“可口性”包括所有可为人或动物感受的食品性状。这些性状不仅包括香味，也包括味道和质地(texture)。也认为术语“可口性”包括食品的其他性状，例如可消化性(digestibility)。术语“可口性提高制剂”被认为包括具有所需可口性性状，或者当存在于任何食品时可有效提高所述食物其他组分的可口性(例如口味)的物质。
本文所用术语“衍生物”在涉及到单细胞蛋白质物质，例如微生物培养物的使用时，包括任何可用本领域已知下游加工技术或多项技术(例如一系列的技术)从所述物质衍生的产物，所述技术例如为通过离心和/或超滤方法从发酵培养基或液体分离单细胞蛋白物质。用于本文所述方法的优选单细胞蛋白质物质的匀浆化衍生物，其中所述细胞被裂解(disrupted)或分解(disintegrated)，例如作为机械裂解(mechanicaldisruption)的结果，从而释放出所述细胞的内容物。此匀浆化物质通常由含有可溶和颗粒化细胞组分的粘性蛋白质浆液(slurry)组成。
在本发明方法中通常通过在小心控制的条件下温育所述细菌培养物进行自溶。合适的温育条件能够引发(initiating)内源性酶活性，因而产生可容易为本领域技术人员测定的自溶产物。优选在无任何自溶引发剂或刺激剂时进行自溶。
温度条件将能够不失活所述酶就使水解最优化，其取决于所选用于所述方法的酶或酶系统。通常，用于自溶的温度将在25-58℃，优选40-55℃，特别优选45-55℃，特别是50-55℃的范围。优选朝向此范围上限的温度，例如约55℃。如果用较低的温度(例如20℃或更低)，自溶就进行得很慢。在使用细菌荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus，M.capsulatus)时，所述温育温度不应超过58℃。在超过此温度的温度时，就会出现包含在所述细胞内的内源性酶(例如蛋白酶和肽酶)的失活。
用于自溶的合适pH范围可在6.2-8.5，优选7.0-8.0，特别优选7.0-7.5的范围。自溶不能在低于约5.5的pH进行。特别优选pH约7.0。为在自溶中将所述生物量的pH维持在所需范围内，所需加入的任何碱的性质、量和时间可很容易由那些本领域技术人员来确定。调节pH的合适的碱包括氢氧化钠，氢氧化钾等。
所述自溶产物可以连续或分批(batchwise)方法来生产。优选以连续方式生产。在分批生产时，所述生物量的pH在所述反应起始阶段，例如在温育步骤开始后30分钟到1小时可迅速下降。这被认为是由于所述肽键的裂解造成的。因此，在此阶段，需要将所述pH维持在所需范围内的碱量需要增加。此后，需要的碱量通常下降。在自溶中可用本领域标准方法调节pH。所述方法包括通过滴定结合加入适当的酸/碱来连续检测pH。
自溶的反应时间通常在30分钟到24小时的范围，例如1-5小时。优选反应时间为约4小时。通常，自溶产物的产率随反应时间增加。然后，可根据所需的自溶产物产率选择温育时间。
通常在搅拌釜(stirred-tank)反应器或活塞流(plug-flow)反应器中进行自溶步骤。
本文所述自溶步骤预计产出的产物，其包含40-75重量％，例如约50重量％的不可溶物质(例如包含细胞壁碎片等)，和25-60重量％，例如约50重量％的可溶物质(本文也指“可溶部分”)，该可溶物质通常包含游离(free)氨基酸(特别是谷氨酸)，肽和核苷酸(主要是3′-核苷酸)。
用于本发明方法的细菌生物量可通过所述细菌在合适培养基或底物上生长来形成。用来生产所述生物量的生长培养基的确切性质对于本发明的表现并不关键，可使用数种合适的底物。
便利的是，用于本发明方法的单细胞物质可用发酵方法来生产，在该方法中将氧和合适的底物如液体或气态烃(hydrocarbon)，醇或碳水化合物，例如甲烷，甲醇或天然气，和营养矿物溶液一起加到含所述一或多种微生物的管状反应器。本领域已知并且描述了若干此种方法，例如WO 01/60974，DK-B-170824，EP-A-418187和EP-A-306466。特别优选根据本发明水解的生物量，其生产见PCT/GB02/003798描述(其附件随同递交)其内容在此引入本文作为参考。
特别优选用于本发明的是单细胞蛋白物质，其衍生自烃部分(fractions)或天然气的发酵物。特别优选的是衍生自天然气发酵物的单细胞蛋白质。当发酵罐(fermentor)中微生物的浓度增加，就取出所述反应器内含物或培养液(broth)的一部分，并且可用本领域已知技术，例如通过离心和/或超滤分离所述微生物。在此发酵步骤中，可方便地从所述发酵罐中连续取出所述培养液，并且培养液的细胞浓度为1-5重量％，例如约3重量％。
可用本发明方法处理从两种或更多微生物生产的单细胞物质。尽管可在同一或分开的发酵罐中生产，一般会在同一的发酵罐中在相同的发酵条件下生产。用分开的发酵方法生产的物质可在本发明水解步骤前混合。
优选用于本发明的细菌包括荚膜甲基球菌(Bath)，原来从英格兰巴斯(Bath)的热喷泉分离的嗜热(thermophilic)细菌，它保藏在国立工业海洋细菌收藏所(The National Collections of Industrial and Marine Bacterium)，Aberdeen，Scotland，作为NCIMB 11132。尽管它在37℃-52℃之间可以出现生长，荚膜甲基球菌(Bath)在约45℃最适生长。该细菌是草兰氏阴性的，不能动(non-motile)球形细胞，通常成对出现。它的细胞内膜以I型甲烷营养菌所特有的成束的囊状盘(bundles of vesicular discs)来排列。荚膜甲基球菌(Bath)基因上是无已知质粒的很稳定的生物体。它可利用甲烷或甲醇来生长并且利用氨，硝酸盐或分子氮作为蛋白质合成的氮源。
用天然气作为唯一的碳和能量来源的发酵方法的一个实施例在EP-A-306466(Dansk Bioprotein)中描述。此方法是基于持续发酵靠甲烷生长的所述甲烷营养型细菌荚膜甲基球菌。空气或纯氧被用于氧合(oxygenation)并且氨被用作氮源。除了这些底物，所述细菌培养物通常需要水，磷酸盐(例如磷酸)和若干矿物质，其可包括，通常以硫酸盐，氯化物或硝酸盐应用的镁，钙，钾，铁，铜，锌，锰，镍，钴和钼。所有在生产所述单细胞物质中使用的矿物质的质量应该为食品级别(food-grade)。
尽管其组分(composition)对于不同气体域(field)会变化，天然气主要由甲烷组成。通常，可希望天然气包含约90％的甲烷，约5％的乙烷，约2％的丙烷和一些更高级(higher)的烃。在天然气发酵过程中，甲烷被甲烷营养型细菌氧化为生物量和二氧化碳。甲醇，甲醛和甲酸是代谢中间产物。甲醛和一些二氧化碳被吸收(assimilated)到生物量内。然而，甲烷营养型细菌不能利用含碳碳键的底物来生长，并且天然气的剩余组分，即乙烷，丙烷和一些更高级的烃灰被甲烷营养型细菌氧化产生相应的羧酸(例如乙烷被氧化为乙酸)。此产物可抑制甲烷营养型细菌，因此在生产所述生物量时，重要的是它们的浓度要保持低，优选低于50mg/l。此问题的一个解决办法是组合使用一或多种异养型细菌，该细菌能利用由所述甲烷营养型细菌生产的代谢产物。此细菌也能够利用所述细胞裂解释放到发酵培养液中的有机物质。为避免泡沫形成这是重要的，并且这也使所述培养物被不需要的细菌污染的风险降到最低。甲烷营养型和异养型细菌的组合可得到稳定并且高产的培养物。
用于本发明的合适异养型细菌包括DB3，菌株NCIMB 13287(Ralstonia sp.以前叫做Alcaligenes acidovorans)；DB5，菌株NCIMB 13289(Bevibacillus agri以前叫做坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus))和DB4，菌株NCIMB 13288(Aneurinibacillus sp.以前叫做短芽孢杆菌(Bacillus brevis))，其每种都在约45℃的温度最适生长。
DB3是革兰氏阴性，需氧的，能动杆菌，它属于Ralstonia属，其可利用乙醇，乙酸盐丙酸盐和丁酸盐来生长。DB4是革兰氏阳性，形成孢子内壁(endospore-forming)，需氧的芽孢杆菌，它属于Aneurini芽孢杆菌属，其可利用乙酸盐，D-果糖，D-甘露糖，核糖和D-塔格糖。DB5是革兰氏阳性，形成内生孢子，能动型，需氧芽孢杆菌，它属于短芽孢杆菌属，其可利用乙酸盐，N-乙酰-葡糖胺，柠檬酸盐，葡糖酸，D-葡萄糖，甘油和甘露醇。
用于本发明的单细胞蛋白质物质特别优选是微生物培养物，它由甲烷营养型细菌可选与一或多种异养型细菌组合，特别优选甲烷营养型和异养型细菌的组合。本文所用术语“甲烷营养型”包括任何利用甲烷，甲醇或甲醛来生长的细菌。术语“异养型”用于描述利用甲烷，甲醇或甲醛之外的有机底物来生长的细菌。
特别优选用于本发明的是包含如下组合物的微生物培养物甲烷营养型细菌荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，和所述异养型细菌DB3(菌株NCIMB 13287)和DB5(菌株NCIMB 13289)，它们可选与DB4(菌株NCIMB13288)组合。DB3的作用是利用荚膜甲基球菌(Bath)从天然气中的乙烷和丙烷生产的乙酸和丙酸。DB3可占所得生物量总细胞计数的最多10％，例如约6-8％。DB4和DB5的作用是利用培养基中的分裂产物和代谢产物。通常，DB4和DB5均占持续发酵中细胞计数的1％以下。
在生产所述单细胞物质过程中，一般调节所述发酵混合物的pH到约6-7，例如6.5±0.3。本领域技术人员可很容易选择调节pH的合适的酸/碱。特别合适的用于此方面的是氢氧化钠和硫酸。在发酵过程中发酵罐内的温度优选保持在40℃-50℃，最优选45℃±2℃。
用于制备所述单细胞物质的合适发酵罐是那些环状(loop-type)，如Dansk Bioprotein的DK 1404/92，EP-A-418187和EP-A-306466所述的那些，或气升式(air-lift)反应器。具有静止混合物(static mixer)的环状发酵罐室由于其活塞流的特性使气体的利用率高(例如至多95％)。气体在沿所述环的数个位置导入并保持与所述液体接触直到它们在反应器顶部空间(headspace)分离。用2-3％生物量(以干重为基)和稀释率0.02-0.50h-1，例如0.05-0.25h-1来连续发酵。
其他发酵罐可在制备所述单细胞物质中使用，它们包括管状(tubular)和搅拌釜发酵罐。
典型地，通过发酵天然气生产的生物量将包含为60-80重量％的粗蛋白质；为5-20％的粗脂肪；为3-10重量％的灰；为3-15％的核酸(RNA和DNA)；10-30g/kg的磷；至多350mg/kg的铁；和最多120mg/kg的铜。特别优选，所述生物量包含为68-73重量％，例如约70％的粗蛋白质；为9-11重量％，例如约10％的粗脂肪；为5-10重量％，例如约7％的灰；为8-12重量％，例如约10％的核酸(RNA和DNA)；10-25g/kg的磷；至多310mg/kg的铁；和至多110mg/kg的铜。所述蛋白质内含物的氨基酸分布图(profile)应该是营养性好的(nutritionally favourable)，其中较重要的氨基酸半胱氨酸，蛋氨酸，苏氨酸，赖氨酸，色氨酸和精氨酸比例高。通常这些氨基酸可分别以约0.7％，3.1％，5.2％，7.2％，2.5％和6.9％的量存在(表示为总氨基酸量的百分比)。一般所述脂肪酸主要包含饱和棕榈酸(约50％)和单不饱和棕榈酸(约36％)。所述产物的矿物内含物通常包含大量的磷(约为1.5重量％)，钾(约为0.8重量％)和镁(约为0.2重量％)。
通常所得生物量以流动液体糊或匀浆的形式生产。通常它基本包含全细胞物质，尽管一定比例的裂解细胞物质也可能存在。
在所述生物量产生后，一般从所述发酵培养基，例如用常用的离心和/或过滤方法，例如超滤来浓缩它。浓缩所述生物量可仅用离心来进行。在离心过程中，所述生物量内含物的干物质通常被提高到为约5-18重量％，优选为8-15％，例如约14％。如果必要，或事实上需要的话，可用过滤(例如超滤)方法进一步提高所述生物量的固体含量。可在40-50℃，例如42-46℃的温度进行超滤，并将所述生物量浓缩为包含单细胞物质为10-30重量％，优选15-25％，例如18-22％的产物。在超滤中使用的尺寸排阻(size exclusion)一般在约100,000道尔顿。所得生物量将会是水浆液的形式并且通常固体含量为10-30重量％，优选15-25％，例如约20％。
自溶之前可选匀浆化所述生物量，来使所述微生物细胞壁裂解，从而从所述细胞结构内释放出部分蛋白质物质。如果必要，所得匀浆化物质可用再滤过(例如超滤)方法来处理。
匀浆化可生产出包含，优选基本由裂解的细胞物质组成的产物。例如，裂解的细胞物质以至少80重量％，优选90％存在。通常，所述产物是比较粘的蛋白质匀浆，其包含可溶和颗粒化细胞组分。
所述匀浆化步骤被认为对于终产物的口味特性(即味道(taste))几乎无效果，但可用来提高所述自溶物质的可溶部分的干物质产率。例如，它可提高所述可溶部分的干物质含量20-25％。所述干物质含量提高的程度也取决于所述自溶过程的持续时间。匀浆化物质自溶24小时可，例如，预期得到可溶部分产率最多为60重量％的产物。在自溶前无匀浆化步骤时，所述可溶部分的产率预期为约50重量％。
裂解或分解所述细胞，可例如，通过机械方法如通过一系列加压(pressurizing)和压缩(depressurizing)所述微生物物质来完成。尽管匀浆化可用任何常用手段进行，优选通过高压匀浆化步骤来进行，在高压匀浆化步骤中所述生物量经受压力改变，优选经受能进行细胞分解的压力下降。通常，所述物质经受的压力下降为40MPa-120MPa(400-1200bar)，更优选50MPa-110MPa(500-1100bar)，例如60MPa-100MPa(600-1000bar)。特别优选压力下降约1000bar。通常，所述压力下降是瞬时的(instantaneous)。通常在工业化匀浆器，例如得自APV Rannie，Denmark，在可控温度条件下，进行所述步骤，所述温度优选在低于58℃，特别优选25-50℃，例如25-35℃。适合本发明所用的匀浆化步骤见例如，WO 01/60974(to Norferm DA)所述。
其他本领域已知技术也可用来进行本发明的匀浆化。例如，可通过用能裂解细胞壁的剪切力处理所述单细胞来进行匀浆化。可用一个混合器，其中所述物质通过一个剪切力的区域，在该区域中通过表面相对运动来施加剪切力。通常，此剪切力在一个移动表面，例如旋转表面，和一个静止表面产生，即象转子-定子之间那样，如WO99/08782所述。
其他已知用于机械细胞分解方法中的技术，例如高速球碾磨(ball milling)可用来进行匀浆化。超声方法也可用。
本发明优选方面提供了生产饲料或饲料组分，例如可口性提高物质(例如口味提高剂)的方法，所述方法包含下列步骤(a)制备微生物培养物的水浆液，其包含甲烷营养型细菌可选与一或多种异养型细菌的组合；(b)可选匀浆化所述浆液，优选使所述匀浆经受能够进行细胞分解的压力下降，例如40MPa-120MPa，优选50MPa-110MPa，特别为60MPa-100MPa的压力下降，来生产匀浆化产物；并且(c)使所得产物自溶。
自溶后，优选在温度58-75℃，优选65-69℃，例如约67℃加热所述自溶产物。
所述自溶产物包含可溶和不可溶细胞物质的混合物。尽管这可被直接(即无进一步加工)用作食品中的组分或前体(例如作为可口性提高调味组分)，还是优选分离所述不可溶细胞物质。这可以通过本领域已知分离方法，优选通过过滤，例如超滤来进行。可在温度40-75℃，例如50-70℃进行超滤，可有效滤出能够穿过(cross)所述滤膜的核苷酸和其他小分子。主要用于食品，例如提高可口性制剂生产的是此可溶或可渗透部分。在超滤中所用的尺寸排阻通常在约20kD的范围。然而，可用截留分子量(MW cut-off)为10-100kD的滤膜。为提高产物的产量，可在附加的超滤步骤后用水重复清洗所述自溶产物(例如至多5次，例如至多3次)。
在分离所述自溶产物后，所述可溶部分的固体含量预期为3-8重量％。谷氨酸和游离氨基酸的含量(以干物质为基)预期分别为约5-11％和40-50％。
如果需要，所述产物水含量的进一步降低可通过本领域已知蒸发方法来完成。例如，可用它来生产固体含量为20-70重量％，例如约为30％的产物。合适的蒸发方法包括降升膜式(falling-raising film)蒸发法，降膜式(fallingfilm)蒸发法和闪蒸法(flash evaporation)。必要的话，所述蒸发步骤可重复多次，例如三次。蒸发过程中如果出现起泡问题，可加入抗起泡剂，如KirnolV39360(得自Gruau Illertissen GmbH，Germany)。需要避免起泡的抗泡剂的量可很容易由那些本领域技术人员来确定。抗泡剂的大致的量可为0.01-0.05重量％，例如约0.02％。
在蒸发所述产物后优选立即冷却，例如到5-20℃的温度，例如约15℃的温度。
通常，所述产物还用本领域已知的喷雾干燥(spray drying)技术来处理。可用任何常用的喷雾干燥器(spray drier)，有或无液化床(fluid bed)单位，例如购自APVAnhydro，Denmark的3型-SPD喷雾干燥器。优选，喷雾干燥器的气体进气口的温度可为约140-250℃，出口温度可为约80-95℃。优选所得产物具有的水含量在约1-10重量％，例如2-7％。
所得产物吸湿性极强，因此应该贮藏在低温无湿气的环境中(例如干袋子中)。
本文所述水解方法的结果是本发明生产的产物富含游离氨基酸，特别是谷氨酸，和肽。此产物颜色一般为白(pale)，口味(taste)中性，在水中高度可溶(例如完全可溶来生产1％的温水溶液)。它们特别用作食品中的组分或前体，特别当用作可口性提高剂或调味料时，例如可提高人或动物食物(例如动物饲料)的口味。
本发明另一方面提供了衍生自含甲烷营养型细菌生物量，或其衍生物(例如匀浆化衍生物)的自溶产物，该产物的氨基酸含量为40-80重量％，例如50-60％(基于干物质计算)。本发明的优选产物具有的谷氨酸含量为5-11％，例如8-10％(基于干物质计算)。
本发明另一方面提供了本文所述的自溶物质或其加工衍生物在饲料前体中或作为饲料前体，优选作为可口性提高剂，例如作为口味组分的用途。
本发明另一方面提供了包含本文所述的自溶物质或其加工衍生物的食品。
当用作食品中的可口性提高剂时，所述自溶物质或被加工的自溶物质，将以使其口味和/或气味可被食用者观察到的有效量来使用。特别优选，将它以提高所述食品可口性的有效量应用。通常，可以0.1-4重量％，优选至多2％的量来应用它。其精确比例依靠数项因素，不仅仅是该产物所加入的食物的性质，应用的方式或包括它们的逐项(inclusion)等。合适的水平可容易为本领域技术人员确定。
本文所述自溶产物可被用作传统酵母衍生物的替代物。可加入所述产物的食物包括人和动物食物。例如，可以将它掺入人食用的食品如汤，肉汁，调味品(dressings)，肉食品如肉球，乳液如蛋黄酱(mayonnaise)，等。
本文所述方法的副产物是在分离所述自溶物质之后生产的残留物(retentate)(即不可溶部分)。此产物一般包含组分如蛋白质，脂肪和碳水化合物，所以具有高的营养价值。例如，此产物可具有如下特性水含量(根据M1011)测定)1-10wt.％，例如约4wt.％；灰含量(据欧共体委员会指示(EU Commission Directive)No.162/67/ 测定)3-12wt.％，例如约10wt.％；粗脂肪(Crude)(根据欧共体委员会指示No.93/28/ 测定)10-20wt.％，例如约15wt.％；粗蛋白质(根据欧共体委员会指示No.72/199/ 测定)40-60wt.％，例如约54wt.％；RNA(根据M1052)测定)4-10wt.％，例如约6wt.％；DNA(根据M1052)测定)2-5wt.％，例如约3wt.％；总氨基酸含量(根据M2953)测定)39-41wt.％；总碳水化合物(根据M1404)测定)最多15％wt，例如1-12％wt，通常约10％wt；并且体内可消化性(根据M1505)测定)N的65-85％，例如约N的65％。
1样品中的水在105℃过夜蒸发。通过干燥之前和之后称重来测定所述水含量。
2见Herbert等，Chemical Analysis of Microbial cells，Methods Microbiol.5B285-328，1971。
3见Waters AccQ.Tag Chemistry Package.Instruction Manual 052874TP，Rev.1，和Wandeln等Journal of Chromatography A，763，11-22。
4见Herbert等，Chemical Analysis of Microbial cells，Methods Microbiol.5B267-269，1971。
5见Boisen，CAB International，p.135-145，1991。
此副产品可用于食品，特别作为动物饲料的营养添加剂。也发现它具有好的乳化性质，因此可用作任食品中的乳化剂。此产物及其在食品形式中的用途是本发明其他方面。
本发明现用如下非限制性实施例来更具体地详述，参考如下附图
图1通过图示来实施本发明方法的装置；图2显示在本发明数种自溶物在超滤(截留分子量20,000D)后，所述干物质含量作为温育时间的函数；图3显示本发明数种自溶物，所述氮含量作为温育时间的函数；图4显示本发明数种自溶物，所述MSG含量作为温育时间的函数；图5显示本发明数种自溶物，所述α-N含量作为温育时间的函数；图6显示本发明数种自溶物的游离氨基酸的含量；图7显示在本发明自溶产物(自溶物-3)，所述游离氨基酸含量作为温育时间的函数；图8通过图示本发明自溶过程的时程；图9是pH比时间的曲线(plot)；图10是pH比时间的曲线；图11是粘度比时间的曲线；并且图12是粘度比时间的曲线；实施例1-制备自溶物将包含荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，DB3(菌株NCIMB13287)和DB5(菌株NCIMB 13289)的微生物培养物在环状发酵罐中生产，该生产是通过在氨/矿物盐培养基(AMS)在45℃，pH 6.5连续有氧发酵天然气进行的。每升此AMS培养基含如下物质10mg NH3，75mg H3PO4·2H2O，380mg MgSO4·7H2O，100mg CaCl2·2H2O，200mg K2SO4，75mgFeSO4·7H2O，1.0mg CuSO4·5H2O，0.96mg ZnSO4·7H2O，120μgCoCl2·6H2O，48μg MnCl2·4H2O，36μg H3BO3，24μg NiCl2·6H2O和1.20μg NaMoO4·2H2O。
该发酵罐充满在125℃被热处理10秒的水。根据消耗量(consumption)调节不同营养物的加入。随时间逐渐积累，用1-3％生物量(以干重为基)来进行连续发酵。
在工业连续离心机中以3,600rpm离心所述生物量，之后之后用排阻尺寸20,000道尔顿的膜进行超滤。包含约12-20重量％的生物量的所得产物，然后可选在工业匀浆器中被匀浆化处理(压力下降1000bar(100MPa)；入口温度15℃)来生产匀浆化的生物量。
加热所述12％的生物量悬液到最适反应温度55℃并通过加入NaOH将所述pH调节到7.0-7.5。温育4小时，在此段时间中将所述物质的温度保持在50-55℃并将所述pH保持在7.0-7.5。
在温育后，将生物量在温度50-70℃用截留分子量约20kD的膜进行超滤。必要的话，用水重复清洗所述生物量，之后在进行再次超滤来提高所需的渗透物(permeate)产率，该渗透物含有约4.2重量％的干物质。
冷却所得渗透物并在蒸汽处理之前将其贮藏在密封的容器中。
在有抗起泡剂时，在温度60-70℃蒸发会进一步将所述渗透物的固体含量增加到约35重量％。
实施例2-自溶物制备和性质方法根据下述步骤生产自溶物1.如实施例1所述通过发酵步骤生产微生物培养物(生物量)。通过离心将所收集的生物量浓缩到以干固体为基的6-8％。
2.匀浆化压力从1000bar降到0bar。
3.将所述匀浆物(homogenizate)超滤处理。
4.如表1调节所述物浓度和pH(见下)。
5.温育4小时。
6.温育后，分离出1.1L过滤物(20,000截留分子量)。
7.在90℃加热所述滤过物10分钟。
8.消毒后，冷却所述自溶物并将其置于冰箱(freezer)中。
9.过滤(干固体最多20％)。
10.冷却所述浓缩物并喷雾干燥(入口/出口温度200℃/90℃)，并将所述样本标为自溶物1-5。
表1自溶物1-5的生产参数
*这是匀浆化的生物量在用截留分子量20,000D过滤后的残留物。
在超滤过程中(步骤6)，所述产物(即所述过滤物或渗透物)的性质在各步中测定。在开始温育后30分钟，1小时，2小时和3小时取出100mL的过滤物(自溶物-5的样本只检测最多1小时)。如步骤7所述消毒每个过滤样本。每个样本(和终产物样本，即4小时温育后)，测定干物质含量然后冻干所述样本。分析所述冻干样本的如下性质蛋白，氨基-氮，MSG(谷氨酸)和游离氨基酸含量。
结果和讨论味道试验在味道试验中，只发现自溶物1-4和少量表达的自溶物3参照之间的味道差别最小。“酵母味(yeasty note)”的程度可以和今日所用的标准淡酵母(standard light yeast)相比。自溶物-5的味道不好。
化学分析制备自溶物1-4中，取0.5，1，2，3和4小时的样本来测定所述产物如何随时间形成(develop)。
图2显示多种样本的干物质含量在超滤(截留分子量20,000D)后随时间的增加。所述结果显示，当所述温育温度为45-55℃并且所述pH在7-8时，所述自溶过程进展(progresses)基本呈线性。0.5小时后约30％的干物质，2小时后约40％的干物质，4小时后约48％的干物质通过了滤膜(filter)。较早的试验表明24小时温育后约55％的干物质通过了滤膜。图3显示在温育时间为2-4小时时，所述产物中的氮含量(蛋白质，肽和游离氨基酸)为约11重量％。
2小时温育后，所述自溶物的MSG(谷氨酸)含量基本恒定(见图4)。相对MSG含量通常为3-7％的常用酵母自溶物，特别优选为8-9重量％的谷氨酸含量。
图5显示所述自溶物中蛋白质的水解程度(α-N表示产物中存在的自由α-氨基基团的数目)。所述产物的水解程度的计算如此计算α-N×100％/N。对于本发明水解程度为约60％的每种自溶物，其显示所述产物的一大部分由游离氨基酸组成。这通过氨基酸分析来确定(见表2)，该分析显示所述自溶物的50-60％由游离氨基酸组成。
图6显示在表1所列的条件下温育4小时后，所述自溶物的氨基酸组分。
在不同的自溶条件下，绝大部分释放出等同量的所述氨基酸。如所预计的，在自溶物-3中观察到高含量的精氨酸，在A-1和A-2中观察到大量的脯氨酸。与A-5比较表现出脯氨酸的释放与45℃的温育温度相关。A-1的谷氨酸含量比其它产物的谷氨酸含量低。只在A-1和A-3(在pH 7温育)观察到少量谷氨酰胺。此小变化提示是相同的酶在所研究的加工条件(pH7-8和温育温度45-55℃)起作用(operate)。
图7显示A-3的游离氨基酸含量作为对于时间的函数。氨基酸分布图(profile)中在温育0.5-4小时中看不到特别的不同，这意味着所述温育时间基本根据所需的超滤后产率来选择(见图2)。
结论可以改变开始物质的干物质含量(步骤1)和温育时间，而不影响所述自溶产物的重要参数(高MSG和游离氨基酸含量，总溶解度，白色，适中口味)。干物质或温育时间增加降低产率。可根据剩余副产品中蛋白水解的所需程度来确定最适产率。
表1猫薄荷(土荆芥)香精油商品试样和经蒸汽蒸馏纯化后的馏分中存在的荆芥内酯立体异构体的13C化学位移和摩尔％值
该分析表明，荆芥内酯以下述的比例存在于所述油中80.2摩尔％顺式，反式-荆芥内酯，17.7摩尔％反式，顺式-荆芥内酯和2.1摩尔％顺式，顺式-荆芥内酯。这些数据表明，在纯化物质中的荆芥内酯比例为84.5mol％顺式，反式-荆芥内酯，14.3摩尔％反式，顺式-荆芥内酯和1.2摩尔％顺式，顺式-荆芥内酯。对该纯化馏分的GC-MS分析表明其主要由这些荆芥内酯(m/z为166)组成，伴有微量倍半萜类石竹烯和葎草烯(数据没有给出)。
实施例2二氢荆芥内酯的制备将如实施例1所述由猫薄荷油经蒸馏得到的107g荆芥内酯馏分溶解于乙醇(200ml)，并置于装有12.7g 2％Pd/SrCO3(Aldrich41，461-1)的Fisher-Porter瓶中。试管排空和用H2充气两次，然后<p>实施例3-自溶物制备根据下述步骤生产自溶物1.如实施例1所述通过发酵步骤生产微生物培养物(生物量)。通过离心将所收集的生物量浓缩到以干固体为基的12-22％。
2.匀浆化压力从1000bar降到0bar。
3.自溶分别调节温度和pH为50-55℃和7.0-7.5。
4.温育至多4小时。
5.通过加热所述产物到70-90℃来对其消毒。
6.喷雾干燥所述产物(入口/出口温度180-250℃/90℃)。
实施例4-自溶物方法根据下述步骤生产自溶物1.如实施例1所述生产微生物培养物。通过离心和/或超滤将所收集的生物量浓缩到以干固体为基的12-22％。
2.匀浆化压力从1000bar降到0bar。
3.自溶分别调节温度和pH为50-55℃和7.0-7.5。
4.自溶过程中温育2-6小时。
5.匀浆化压力从1000bar降到0bar。
6.将所述产物加热到65-95℃。
7.喷雾干燥所述产物(入口/出口/加料(feed)180-300℃/70-95℃/15-70℃)。
过程实例见图8。其中A＝加热，B＝自溶，C＝冷却。
分析上述方法的自溶产物。其结果见下表3所示。
表3
百分比为重量百分比C1浓缩物自溶前进行匀浆化R1残留物自溶前进行匀浆化C浓缩物自溶R残留物自溶离心后物质和离心后继续超滤的物质的自溶结果基本相同。然而，当样本在自溶之前已经匀浆化，会有很大不同。
实施例5-自溶物的α-氨基含量实施例1所产生的细菌培养物(5℃)在900-1000bar匀浆化，并且贮藏在容器中。匀浆化后，将温度升高到44.5℃。
无温度控制下贮藏一个样本，在4℃无pH外部控制贮藏一个样本。手工记录pH。
表4在贮藏匀浆化培养物时，温度、pH和α-氨基氮(α-N)占干物质的百分比
无温度控制的实验显示开始温度为44.5℃，pH为6.6。24小时后，所述温度为22℃，pH为5.1。在贮藏中所述α-氨基N从1％增加为2％。
带冷却参比样本的实验显示pH无变化。为使此样本pH下降，需要进一步贮藏。在贮藏中所述α-氨基N从1％增加为1.34％。
表4显示所述匀浆化培养物的α-氨基氮含量为所述干物质的1-2％，甚至在贮藏时间延长后。
水解程度的定义为所断裂的肽键百分比。每水解一个肽键形成一个自由α-氨基酸。足以产生口味产品的自溶可用所述干物质的α-氨基酸氮百分比来限定。得到(achieve)口味产品的自溶会使α-氨基氮含量为2-6％，3-5％，或通常为4％wt。例如，基础培养物包含1-1.1％的α-氨基氮，而所述匀浆化产物在如上表4所示的贮藏条件下包含1-2％的α-氨基氮。可通过在pH 7-7.5，温度40℃以上滴定来进一步增加所述匀浆化产物的α-氨基氮。另一方面，pH 5-5.5会使所述生物量稳定。
实施例6-在自溶初始阶段控制pH和粘度在1000bar匀浆化浓缩物(即离心后收集的物质)和残留物(即超滤后收集的物质)，通过热交换手段控制温度。
下表5和表6显示加工参数。
表5-在分批实验至多9小时时，温度和匀浆化浓缩物的干物质含量。C-浓缩物。
表6-在分批实验至多9小时时，温度和匀浆化残留物的干物质含量。R-残留物。
进行分批实验涉及监测仪器，缓冲液釜(tank)和匀浆器。图9显示的是实验概述，其中A为浓缩物或残留物，1是温度对照，2是Red.OX电极，3是pH电极，4是在1000bar的匀浆器，5是培养基进料流(medium feed stream)，6是产物，7是搅拌器，8是自溶反应器。
在装备了反应器模型(Model)FS-314(New Brunswick Scientific Co.Inc NewYersey)的发酵罐发动机集合模型(Fermentor Drive Assembly Model)No.M1200-200中进行匀浆化生物量的分批水解，其总容量为14L，工作容量为10L。如果没有另外阐述，将反应器浸泡在控温水浴(1℃)，进行持续搅拌。输入(log)pH。从外部检查内部pH。反应器操作不需要充气(aeration)，并且搅拌速度为100-300rpm。
如果没有另外阐述，在持续搅拌下泵出(pumping)所述生物量来抽出所述样本。此种情况下，测定pH和粘度。之后冻存样本作以后的分析。
从搅拌釜反应器中取出样本，用Brookfield粘度计在2.5rpm，5rpm，10rpm，30rpm，50rpm和100rpm立即测定。在结果部分只给出了在30rpm的测定。
结果和讨论图10和图11显示所述pH分别作为匀浆化浓缩物和残留物的时间的函数。
见图10和图11，在15℃，5-9小时后，匀浆化浓缩物和残留物的pH稳定。在较高温度，所述pH从6.2-6.4下降到5.2-5.4，并且pH下降率随时间增加。对于匀浆化残留物，所述pH下降率几乎是匀浆化浓缩物速度的两倍。浓缩物和残留物的不同可用所述生物量在不同加工步骤的干物质含量或其状态解释。然而，最终所有试验都稳定在pH 5-5.5。
下降的pH可能由于由有限的肽降解和/或糖转化所形成的酸。糖转化可被用来在自溶物的自溶步骤之前降低还原糖的含量。水解程度(DH)被定义为所断裂的肽键百分比。每水解一个肽键形成一个自由α-氨基酸。所述产品可用所述干物质的α-氨基酸氮百分比来限定。得到口味产品(如上所述)的自溶会使α-氨基氮含量为2-6％，3-5％，或通常4％。
图12和图13显示搅拌反应器中匀浆化浓缩物和残留物的粘度作为各自的时间的函数。
图12和图13显示所述匀浆化浓缩物的粘度低于所述残留物的粘度。在搅拌时，匀浆化浓缩物的粘度低于10cP。匀浆化残留物粘度高于20cP。作为时间的函数，所述粘度显示微小变化1小时后除了35℃的浓缩物实验，其中粘度在4小时后增加。
所述粘度随温度下降。干物质增加会提高粘度。所述粘度作为温度，pH和浓度的函数，应在加工过程中予以控制。例如，可以避免理想的粘度累积从而之后可进行混合(在滴定过程中)。
如果在实验室平台贮藏匀浆化残留物或浓缩物，其粘度增加。这些匀浆也发展成为高粘度的胶样物质。然后，将匀浆化残留物贮藏在温度控制条件下不充气、不搅拌的反应器中。此时不监测pH。
图14显示匀浆化残留物的粘度作为时间的函数，其中在点A所述物质发展成为生面团样(dough like)物质，粘度极大，在B停止测量，在C溶解所述生面团。
与所搅拌的产物相比，根本无需搅拌粘度也会增加。所述匀浆化残留物的粘度的增加，作为时间的函数，并且所述粘度在较高温度增加得更快。在35℃的粘度增加低于27℃的粘度增加，但35℃的起始粘度(和干物质)低于27℃的。
未搅拌的匀浆由于气体形成和聚集作用得到大量体积的生面团样物质。因此，理想的话，应该搅拌所述匀浆化的物质来避免粘度和体积增加。
粘度增加可能是由于来自所述匀浆化生物量的聚合物和细胞碎片的聚集而造成的。聚集使所贮藏的匀浆化生物量的粒径为10-100μm，然而新鲜的匀浆化匀浆微粒小于1.5μm。
应该理想控制匀浆化后的条件，来获得相对粘度好的加工条件。
不滴定的话，所述pH会下降。此pH下降率随温度(15-45℃)上升，并且所述pH可能会反映肽降解和来自糖转化的酸形成。匀浆化生物量的pH在15℃稳定5-9小时，这表示反应速度低，而45℃使pH突然从6.2下降到5.2。所有实验中，所述pH稳定于5-5.5。
权利要求
1.生产饲料或饲料组分的方法，所述方法包括使包含甲烷营养型细菌的微生物培养物或其衍生物自溶。
2.生产饲料或饲料组分的方法，所述方法包含下述步骤(a)制备微生物培养物的水浆液，其包含甲烷营养型细菌可选与一或多种异养型细菌的组合；(b)可选均质化所述浆液；并且(c)使所得产物自溶。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其还包含分离所述自溶产物的步骤。
4.权利要求1到3任一的方法，其中所述培养物已经用甲烷作为碳源来生产。
5.权利要求1到4任一的方法，其中所述培养物包含荚膜甲基球菌。
6.权利要求1到5任一的方法，其中所述培养物还包含异养型细菌。
7.权利要求1到6任一的方法，其中自溶在温度至少25℃进行。
8.通过权利要求1到7任一的方法得到的自溶产物。
9.一种自溶产物，其衍生自含甲烷营养型细菌的生物量或其衍生物，该产物具有的氨基酸成分为干物质量为40-80重量％。
10.权利要求9的产物，其具有的谷氨酸内含物为干物质量为的5-11重量％。
11.权利要求8到10任一的自溶物质或其加工衍生物，在饲料前体中或作为饲料前体的用途。
12.权利要求8到10任一的自溶物质或其加工衍生物作为宠物饲料添加剂的用途。
13.一种食品，其包含权利要求8到10任一的自溶物质或其加工衍生物。
14.权利要求13的食品，其为狗食物或向其加入的添加剂。
15.权利要求13的食品，其为鱼食。
16.权利要求15的食品，其为丸状可挤压的鱼食。
全文摘要
生产饲料或饲料组分，例如可口性提高制剂的方法，所述方法包含使包含甲烷营养型细菌的微生物培养物自溶。
文档编号A23K1/18GK1642441SQ03806228
公开日2005年7月20日 申请日期2003年2月12日 优先权日2002年2月12日
发明者艾纳·莫恩, 亨里克·埃里克森, 简·拉森 申请人:诺弗姆公司