专利名称：细菌水解产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及从细菌生物量(biomass)，特别从包含甲烷营养型细菌的细菌培养物生产可口性(palatability)提高的水解产物的方法。特别发现此产物在人和动物食物用作替代传统酵母衍生物的养分或口味(flavour)提高剂。
背景技术：
近来，开发可掺入人和/或动物食用的食物的蛋白质新来源引起了很多注意。若干含蛋白质的不同物质已被建议作为人类食物中更多传统来源的蛋白质，如鱼粉，大豆(soya)产品和血浆的替代物，并作为动物饲料。这些物质包括含蛋白质微生物(本文也指“单细胞蛋白质”)如真菌，酵母和细菌。
单细胞蛋白质物质可被直接用于食物，例如作为喷射干燥(spray dried)产物，或者所述生物量可在使用前，例如用技术如均一化和/或分离，来进一步处理。例如，WO01/60974公开生产具有优异功能特征的细菌生物量的均一化衍生物的过程，该衍生物可在数种食品制备中用作，例如胶凝剂或乳化剂。
今日，大多广泛应用的单细胞蛋白质衍生自真菌或酵母。例如，众所周知酵母用于酿造，制酒和培烤产业。数种酵母加工衍生物也已知用于制备饲料。例如，酵母自溶(autolysis)产生数种已知的用作食品中调味料(flavouring)或调味品(seasoning)的细胞组分，例如在调味料(sauce)，肉汁(gravies)等的制备过程中。然而，一般需要相对大量的酵母自溶物(autolysate)来获得所需的口感提高的效果。并且，酵母自溶一般缓慢而且需要数天来完成适宜程度的消化。因此一般需要作为自溶引发剂(initiator)或刺激剂(stimulator)的添加剂，例如巯基试剂，来加快所述自溶方法。这增加了商业生产酵母自溶物的成本。
对能增加人和动物食品可口性的替代物质，特别是可以大量生产并且成本相对低的物质的需要是持续的。特别需要能作为口味提高剂的物质。
发明内容
现在我们惊喜发现用酶法水解含甲烷营养型细菌的生物量，具有生产有效的可口性提高组分，特别是口味组分的效果，该组分也被用作养分，即饲料或饲料组分。
因此，一方面，本发明提供生产饲料或饲料组分，例如可口性提高制剂的方法，所述方法包含用酶法水解处理包含甲烷营养型细菌的微生物培养物。通过此方法生产的水解产物是本发明的另一方面。
本发明生产的水解产物通常可被用作鱼或贝壳类动物(shellfish)的饲料或饲料组分，例如见PCT/GB02/03795描述(其附件随同递交)其内容引入本文作为参考。类似，所述水解产物可特别被用作宠物食物，特别是狗食的口味提高剂，例如见英国专利申请No.0203907.1描述(其附件随同递交)其内容引入本文作为参考。
本发明水解产物特别优选用作丸状可挤压(extruded)鱼食的组分。所述鱼食丸通常也包含蛋白质和脂质，例如鱼粉和鱼和/或植物油，及少量碳水化合物，例如植物源淀粉。
本文所用术语“可口性”包括所有可为人或动物感受的食品性状。这些性状不仅包括香味，也包括味道和质地(texture)。也认为术语“可口性”包括食品的其他性状，例如可消化性(digestibility)。术语“可口性提高制剂”被认为包括具有所需可口性性状，或者当存在于任何食品时可有效提高所述食物其他组分的可口性(例如口味)的物质。
在存在一或多种能够水解(例如通过水解降解)所述细胞结构和/或细胞内组分的酶，优选能够水解所述细胞核酸成分的酶或酶系统时，进行本发明方法中的水解。本领域技术人员可很容易地确定能够进行水解的合适的酶和酶系统。优选，这些包括能够水解所述生物量的DNA和/或RNA成分(优选所述RNA成分)来生产相应的核苷酸，优选5′-核苷酸的核酸酶。此酶的实施例是Enzyme RP-1(得自AmanoPharmaceutical Co.，Ltd.)。Enzyme RP-1是能够将RNA水解为核苷酸如5′-AMP，5′-GMP，5′-CMP和5′-UMP的5′-磷酸二酯酶(E.C.No.2.7.7.16，CAS No.9001-99-4)制备物。
优选，具有5′-腺苷脱氨酶活性并因此能够将5′-AMP转化为5′-IMP的酶可与所述(一或多种)核酸酶组合(同时或，更优选分开，例如顺序)使用。已发现此处理增加了提高所述最终水解产物可口性的效果。Deamizyme 50000(Amano PharmaceuticalsCo.，Ltd.)是此具有5′-腺苷脱氨酶强活性的酶的一个实施例。它在pH范围4.0-7.0是稳定的，并且最适pH为约5.6。
在本发明一方面，能够水解所述细胞核酸成分的酶或酶系统可与至少一种能够进行蛋白质水解的蛋白酶组合使用。它具有提高所述最终产物的5′-核苷酸成分的效果并也能使任何苦的蛋白质水解产物脱去苦味，从而提高味道的开发。根据每种酶的性质(即最适温度，pH等)，可同时使用它们来处理所述细菌生物量。然而，通常，用所述核酸酶和蛋白酶酶/酶系统处理可分开，例如顺序进行。适用于本发明方法的一个蛋白酶实施例是Flavourzyme(得自Novo Nordisk A/S，Denmark)。Flavourzyme是真菌蛋白酶/肽酶复合物，其含有内切蛋白酶和外切蛋白酶(exoprotease)并能够在中性或微酸性条件下水解蛋白质。其它可用于本发明方法的蛋白水解酶包括Alcalase(得自NovoNordisk，Denmark)和Promod 298L(Biocatalysts)。然而，这些酶一般不如Flavourzyme优选，因为它们具有能降解5′-核苷酸的磷酸酶的一定程度的次级活性(secondary activity)。
可进行水解并因此产生水解产物的适宜条件依赖于所用酶或酶系统的确切性质，它可由本领域技术人员容易地确定。
温度条件将能够不失活所述酶就使水解最优化，其取决于所选用于所述方法的酶或酶系统。通常，用于水解的温度将在30-75℃，优选40-70℃的范围。如果用较低的温度(例如低于约35℃)，水解就进行得很慢。为避免所述分解酶的失活，所述温度应优选不超过约70℃。为将RNA分解为5′-核苷酸，在用核酸酶，Enzyme RP-1时，在约65℃获得最适产出。
水解的pH条件将类似取决于所选用于所述方法的酶或酶系统。用于水解的合适pH范围可在4.0-7.0，优选5.0-6.0的范围。在用酶RP-1来水解RNA时，优选的pH在5.5±0.25。为在水解中将所述生物量的pH维持在所需范围内，所需加入的任何酸的性质、量和时间可很容易由那些本领域技术人员来确定。调节pH的合适的酸包括硫酸，盐酸等。
所述水解产物可以连续或分批(batchwise)方法来生产。优选以连续方式生产。
用任何已知酶或酶系统处理的反应时间通常在30分钟到24小时的范围。优选反应时间为约1.5-2小时。更长的反应时间一般使所述产物的水解程度增加，并已经发现降低最终水解产物味道中的任何苦味。
在任何已知条件产生水解产物所需要的任何已知酶的量由那些本领域技术人员来确定。一般，可预计该量为0.001-0.5％，例如0.03-0.25％(基于所述生物量的重量)。
所述水解步骤一般在搅拌釜反应器或活塞流反应器中进行。
本文所述水解方法可预计产出的产物，其包含70-95重量％，例如约75重量％的不可溶物质(例如包含细胞壁碎片等)，和5-30重量％，例如约10-20重量％的可溶物质(本文也指“可溶部分”)，该可溶物质通常包含5′-和3′-核苷酸(主要是5′-核苷酸，例如5′-核糖核苷酸)。进行本发明步骤时，特别优选产生的水解产物是富含天然核糖核苷酸，如鸟嘌呤5′-单磷酸盐(5′-GMP)和次黄嘌呤(inosine)5′-单磷酸盐(5′-IMP)的那些。
在本发明优选方面中，所述生物量可在酶水解前被预处理，从而使所述细胞打开(open up)(即增加所述细胞膜的渗透性)。这可通过若干方式来实现。优选，预处理可采取热休克处理的形式，其中所述生物量在温度70-140℃，优选80-135℃，例如85-90℃，被加热30秒-15分钟，例如约2分钟。不希望受理论限制，人们认为该处理通过所述细胞壁蛋白质的变性来增加细胞膜的渗透性，因而使核酸的部分从所述细胞渗透到所悬浮的培养基。
用于本发明方法的细菌生物量可通过所述细菌在合适培养基或底物上生长来形成。用来生产所述生物量的所述生长培养基的确切性质对于本发明的表现并不关键，可使用数种合适的底物。
便利的是，用于本发明方法的单细胞物质可用发酵方法来生产，在该方法中将氧和合适的底物如液体或气态烃(hydrocarbon)，醇或碳水化合物，例如甲烷，甲醇或天然气，和营养矿物溶液一起加到(are fed)含所述一或多种微生物的管状反应器。本领域已知并且描述了若干此种方法，例如WO01/60974，DK-B-170824，EP-A-418187和EP-A-306466。特别优选根据本发明水解的生物量，其生产见PCT/GB02/003798描述(其附件随同递交)其内容在此引入本文作为参考。
特别优选用于本发明的是单细胞蛋白物质，其衍生自烃部分(fractions)或天然气的发酵物。特别优选的是衍生自天然气发酵物的单细胞蛋白。当发酵罐中微生物的浓度增加，就取出所述反应器内含物或培养液的一部分，并且可用本领域已知技术，例如通过离心和/或超滤分离所述微生物。便利的是，在此发酵步骤中，从所述发酵罐中连续取出所述培养液，并且培养液的细胞浓度为1-5重量％，例如约3重量％。
可用本发明方法处理从两种或更多微生物生产的单细胞物质。尽管可在同一或分开的发酵罐中生产，一般会在同一的发酵罐中在相同的发酵条件下生产。用分开的发酵方法生产的物质可在本发明水解步骤前混合。
优选用于本发明的细菌包括荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus，M.capsulatus)(Bath)，原来从英格兰巴斯(Bath)的热喷泉分离的嗜热(thermophilic)细菌，它保藏在国立工业海洋细菌收藏所(The NationalCollections of Industrial and Marine Bacterium)，Aberdeen，Scotland，作为NCIMB 11132。荚膜甲基球菌(Bath)在约45℃最适生长，尽管在37℃-52℃之间可以出现生长。该细菌是革兰氏阴性的，不能动(non-motile)球形细胞，通常成对出现。它的细胞内膜以I型甲烷营养菌所特有的成束的囊状盘(bundles of vesicular discs)来排列。荚膜甲基球菌(Bath)基因上是无已知质粒的很稳定的生物体。它可利用甲烷或甲醇来生长并且利用氨，硝酸盐或分子氮作为蛋白质合成的氮源。
用天然气作为单个碳和能量来源的发酵方法的一个实施例在EP-A-306466(Dansk Bioprotein)中描述。此方法是基于持续发酵靠甲烷生长的所述甲烷营养型细菌荚膜甲基球菌。空气或纯氧被用于氧合(oxygenation)并且氨被用作氮源。除了这些底物，所述细菌培养物通常需要水，磷酸盐(例如磷酸)和若干矿物质，其可包括，通常以硫酸盐，氯化物或硝酸盐应用的镁，钙，钾，铁，铜，锌，锰，镍，钴和钼。所有在生产所述单细胞物质中使用的矿物质的质量应该为食品级别(food-grade)。
尽管其组分(composition)对于不同气体域(field)会变化，天然气主要由甲烷组成。通常，可希望天然气包含约90％的甲烷，约5％的乙烷，约2％的丙烷和一些更高级(higher)的烃。在天然气发酵过程中，甲烷被甲烷营养型细菌氧化为生物量和二氧化碳。甲醇，甲醛和甲酸是代谢中间产物。甲醛和某种程度上的二氧化碳被吸收(assimilated)到生物量内。然而，甲烷营养型细菌不能利用含碳碳键的的底物来生长，并且天然气的剩余组分，即乙烷，丙烷和某种程度更高级的烃灰分被甲烷营养型细菌氧化产生相应的羧酸(例如乙烷被氧化为乙酸)。此产物可抑制甲烷营养型细菌，因此在生产所述生物量时，重要的是它们的浓度要保持低，优选低于50mg/l。此问题的一个解决办法是组合使用一或多种异养型(heterotrophic)细菌，该细菌能利用由所述甲烷营养型细菌生产的代谢产物。此细菌也能够利用所述细胞裂解释放到发酵培养液中的有机物质。为避免泡沫形成这是重要的，并且这也使所述培养物被不需要的细菌污染的风险降到最低。甲烷营养型和异养型细菌的组合可得到稳定并且高产的培养物。
用于本发明的合适异养型细菌包括DB3，菌株NCIMB 13287(Ralstoniasp.以前叫做Alcaligenes acidovorans)；DB5，菌株NCIMB 13289(Brevibacillus agri以前叫做坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus))和DB4，菌株NCIMB 13288(Aneurinibacillus sp.以前叫做短芽孢杆菌(Bacillus brevis))，其每种都在约45℃的温度最适生长。
DB3是革兰氏阴性，需氧的，能动杆菌，它属于Ralstonia属，其可利用乙醇，乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐来生长。DB4是革兰氏阳性，形成孢子内壁(endospore-forming)，需氧的芽孢杆菌，它属于Aneurinibacillu，其可利用乙酸盐，D-果糖，D-甘露糖，核糖和D-塔格糖。DB5是革兰氏阳性，形成内生孢子，能动型，需氧芽孢包杆菌，它属于短芽孢杆菌属，其可利用乙酸盐，N-乙酰-葡糖胺，柠檬酸盐，葡萄糖酸，D-葡萄糖，甘油和甘露醇。
用于本发明的单细胞蛋白质物质特别优选是微生物培养物，它由甲烷营养型细菌可选与一或多种异养型细菌组合，特别优选甲烷营养型和异养型细菌的组合。本文所用术语“甲烷营养型”包括任何利用甲烷，甲醇或甲醛来生长的细菌。术语“异养型”用于描述利用甲烷，甲醇或甲醛之外的有机底物来生长的细菌。
特别优选用于本发明的是包含如下组合物的微生物培养物甲烷营养型细菌荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，和所述异养型细菌DB3(菌株NCIMB 13287)和DB5(菌株NCIMB 13289)，它们可选与DB4(菌株NCIMB13288)组合。DB3的作用是利用荚膜甲基球菌(Bath)从天然气中的乙烷和丙烷生产的乙酸和丙酸。DB3可占所得生物量总细胞计数的最多10％，例如约6-8％。DB4和DB5的作用是利用培养基中的分解产物和代谢产物。通常，DB4和DB5均占持续发酵中细胞计数的1％以下。
在生产所述单细胞物质过程中，一般调节所述发酵混合物的pH到约6-7，例如6.5±0.3。本领域技术人员可很容易选择调节pH的合适的酸/碱。特别合适的用于此方面的是氢氧化钠和硫酸。在发酵过程中发酵罐内的温度优选保持在40℃-50℃，最优选45℃±2℃。
用于制备所述单细胞物质的合适发酵罐是那些环状(loop-type)，如Dansk Bioprotein的DK 1404/92，EP-A-418187和EP-A-306466所述的那些，或气升式(air-lift)反应器。具有静止混合物(static mixer)的环状发酵罐室由于其活塞流动的特性使气体的利用率高(例如至多95％)。在沿所述环的数个位置导入气体并保留与所述液体接触直到它们在反应器顶部(headspace)分离。用2-3％生物量(以干重为基)和稀释率0.02-0.50h-1，例如0.05-0.25h-1来连续发酵。
其他发酵罐可在制备所述单细胞物质中使用，它们包括管状(tubular)和搅拌釜发酵罐。
典型地，通过发酵天然气生产的生物量将包含为60-80重量％的粗蛋白质；为5-20重量％的粗脂肪；为3-10重量％的灰分；为3-15重量％的核酸(RNA和DNA)；10-30g/kg的磷；至多350mg/kg的铁；和最多120mg/kg的铜。特别优选，所述生物量包含为68-73重量％，例如约70％的粗蛋白质；为9-11重量％，例如约10％的粗脂肪；为5-10重量％，例如约7％的灰分；为8-12重量％，例如约10％的核酸(RNA和DNA)；10-25g/kg的磷；至多310mg/kg的铁；和至多110mg/kg的铜。所述蛋白质成分的氨基酸分布图(profile)应该是营养性好的(nutritionally favourable)，其中较重要的氨基酸半胱氨酸，蛋氨酸，苏氨酸，赖氨酸，色氨酸和精氨酸比例高。通常这些氨基酸可分别以约0.7％，3.1％，5.2％，7.2％，2.5％和6.9％的量存在(表示为氨基酸总量的百分比)。一般所述脂肪酸主要包含饱和棕榈酸(约50％)和单不饱和棕榈酸(约36％)。所述产物的矿物成分通常包含大量的磷(约为1.5重量％)，钾(约为0.8重量％)和镁(约为0.2重量％)。
通常所得生物量以流动液体糊或匀浆(slurry)的形式生产。通常它基本包含全细胞物质，尽管一定比例的破裂细胞物质也可能存在。
在所述生物量产生后，一般从所述发酵培养基，例如用常用的离心和/或过滤方法，例如超滤来浓缩它。浓缩所述生物量可仅用离心来进行。在离心过程中，所述生物量成分的干物质通常被提高到为约5-18重量％，优选为8-15重量％，例如约14％。如果必要，或事实上需要的话，可用过滤(例如超滤)方法进一步提高所述生物量的固体含量。可在40-50℃，例如42-46℃的温度进行超滤，并将所述生物量浓缩为包含单细胞物质为10-30重量％，优选15-25％，例如18-22％的产物。在超滤中使用的尺寸排阻(size exclusion)一般在约20,000道尔顿。所得生物量将会是水匀浆的形式并且通常固体含量为10-30重量％，优选15-25重量％，例如约20％。
水解之前优选用热处理和/或压力降低方法来处理所述生物量，来使所述微生物细胞壁至少部分破裂，从而从所述细胞结构内释放出部分核酸。
本发明优选方面提供了生产可口性提高物质(例如口味提高剂)的方法，所述方法包含下列步骤(a)制备微生物培养物的水匀浆，其包含甲烷营养型细菌可选与一或多种异养型细菌的组合；(b)可选加热所述匀浆，并且优选在温度70-140℃，更优选80-135℃，例如85-90℃，30秒到15分钟，例如约2分钟；并且(c)用酶法水解作用处理所得产物。
水解后，优选通常在温度50-75℃，优选55-65℃，例如约60℃加热产物约5分钟来失活所述分解酶。
所述水解产物包含可溶和不可溶细胞物质的混合物。尽管这可被直接(即无进一步加工)用作食品中的组分或前体(例如作为可口性提高调味组分)，还是优选将所述不可溶细胞物质从可溶部分分离。这可以通过本领域已知分离方法，优选通过过滤，例如超滤来进行。可在温度35-75℃，例如50-70℃进行超滤，可有效滤出能够穿过所述滤膜的核苷酸和其他小分子。主要用于食品，例如提高可口性制剂生产的是此可溶或可渗透部分。在超滤中所用的尺寸排阻决定渗透物(permeate)的微粒含量，因此根据所述产物的所需性质可选择所述尺寸排阻。通常，所述尺寸在约20kD的范围。然而，可用截留分子量(MW cut-off)为10-100kD的滤膜。为提高产物(所得的5′-核苷酸)的产量，可在附加的超滤步骤后用水重复清洗所述水解产物(例如至多5次，例如至多3次)。
在分离所述水解产物后，所述可溶部分的固体含量预期为1-3.5重量％，例如2.0-2.1重量％。5′-核苷酸的含量(以固体物质为基)预期为约4-15重量％。
如果需要，所述产物水含量的进一步降低可通过本领域已知蒸发方法来完成。例如，可用它来生产固体含量为15-70重量％，例如约为35重量％的产物。合适的蒸发方法包括降升膜式(falling-raising film)蒸发法，降膜式(falling film)蒸发法和闪蒸法(flash evaporation)。必要的话，所述蒸发步骤可重复多次，例如三次。蒸发过程中如果出现起泡问题，可加入抗起泡剂，如Kimol V39360(得自Gruau Illertissen GmbH，Germany)。需要避免起泡的消泡剂的量可很容易由那些本领域技术人员来确定。消泡剂的大致的量可为0.01-0.05重量％，例如约0.02重量％。
在蒸发所述产物后优选立即冷却，例如到5-20℃的温度，例如约15℃的温度。
通常，所述产物还用本领域已知的喷雾干燥(spray drying)技术来处理。可用任何常用的喷雾干燥器(spray drier)，有或无液化床(fluid bed)单位，例如购自APV Anhydro，Denmark的3型-SPD喷雾干燥器。优选，喷雾干燥器的气体进气口的温度可为约250℃，出口温度可为约90℃。优选所得产物具有的水含量在约1-10重量％，例如2-7重量％。
所得产物吸湿性极强，因此应该贮藏在低温无湿气的环境中(例如干袋子中)。
本文所述水解方法的结果是本发明生产的产物富含核苷酸，特别是5′-核苷酸，例如5′-GMP和5′-IMP，并具有高MSG含量。此产物颜色一般为白(pale)到黄，口味(taste)中性，在水中高度可溶(例如完全可溶来生产1％的温水溶液)。它们特别用作食品中的组分或前体，特别当用作可口性提高剂或调味料时，例如可提高人或动物食物(例如动物饲料)的口味。
本发明另一方面提供了衍生自含甲烷营养型细菌生物量的水解产物，该产物核苷酸含量为10-20重量％，例如12-15％(以干物质为基)。本发明优选产物的5′-核苷酸含量为4-15重量％，例如10-14％(以干物质为基)。优选，此产物MSG含量为最多3重量％，例如1-2重量％；蛋白质含量为小于70重量％，例如小于60重量％；并且碳水化合物含量为小于20重量％，例如小于12％。
本发明另一方面提供了本文所述的水解物质或其加工衍生物在饲料前体中或作为饲料前体，优选作为可口性提高剂，例如作为口味组分的用途。
本发明另一方面提供了包含本文所述的水解物质或其加工衍生物的食品。
当用作食品中的可口性提高剂时，所述水解物质或被加工的水解物质，将以使其口味和/或气味可被食用者观察到的有效量来使用。特别优选，将它以提高所述食品可口性的有效量应用。通常，可以0.1-1.0重量％，优选至多0.5重量％的量来应用它。其精确比例依靠几项因素，不仅仅是该产物所加入的食物的性质，应用的方式或包括它们的逐项(inclusion)等。合适的水平可容易为本领域技术人员确定。
本文所述水解产物可被用作传统酵母衍生物的替代物。可加入所述产物的食物包括人和动物食物。例如，可以将它掺入人食用的食品如汤，肉汁，调味品(dressings)，肉食品如肉球，乳液如蛋黄酱(mayonnaise)，等。本文所述的产物特别可用于湿和干的宠物食品，优选干的宠物食品中的调味料。例如，它可以用作狗食的添加剂。
本文所述方法的副产物是在分离所述自溶物质之后生产的残留物(retentate)(即不可溶部分)。此产物一般包含组分如细胞壁碎片并具有高的营养价值。例如，此产物可具有如下特性水含量(根据M1011测定)1-10wt.％，例如约4wt.％；灰分含量(据欧共体委员会指示(EU Commission Directive)No.162/67/E F测定)3-12wt.％，例如约10wt.％；粗脂肪(根据欧共体委员会指示No.93/28/E F测定)10-20wt.％，例如约15wt.％；粗蛋白质(根据欧共体委员会指示No.72/199/E 测定)40-60wt.％，例如约54wt.％；RNA(根据M1052测定)4-10wt.％，例如约6wt.％；DNA(根据M1052测定)2-5wt.％，例如约3wt.％；总氨基酸含量(根据M2953测定)39-41wt.％；总碳水化合物(根据M1404测定)最多15％wt，例如1-12％wt，通常约10％wt；并且体外可消化性(根据M1505测定)65-85％N，例如约65％N。
1样品中的水在105℃过夜蒸发。通过干燥之前和之后称重来测定所述水含量。
2见Herbert等，Chemical Analysis of Microbial cells，Methods Microbiol.5B285-328，1971。
3见Waters AccQ.Tag Chemistry Package．Instruction Manual 052874TP，Rev.1，和Wandeln等Journal of Chromatography A，763，11-22。
4见Herbert等，Chemical Analysis of Microbial cells，Methods Microbiol.5B267-269，1971。
5见Boiscn，CAB International，p.135-145，1991。
此副产品可用于食品，特别作为动物饲料的营养添加剂。此产物及其在食品形式中的用途是本发明其他方面。
本发明现用如下非限制性实施例来更具体地详述，参考附
图1，该图阐述用来实施本发明方法的装置。
实施例1-制备生物量将包含荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，DB3(菌株NCIMB13287)和DB5(菌株NCIMB 13289)的微生物培养物在环状发酵罐中生产，该生产是通过在氨/矿物盐培养基(AMS)在45℃，pH 6.5连续有氧发酵天然气进行的。每升此AMS培养基含如下物质10mg NH3，75mg H3PO4·2H2O，380mg MgSO4·7H2O，100mg CaCl2·2H2O，200mg K2SO4，75mgFeSO4·7H2O，1.0mg CuSO4·5H2O，0.96mg ZnSO4·7H2O，120μgCoCl2·6H2O，48μg MnCl2·4H2O，36μg H3BO3，24μg NiCl2·6H2O和1.20μg NaMoO4·2H2O。
该发酵罐充满在125℃被热处理10秒的水。根据消耗量(consumption)调节加入不同的营养物。随时间逐渐积累，用1-3％生物量(以干重为基)来进行连续发酵。
在工业连续离心机中以3,000rpm离心所述生物量，从而生产含有占生物量约为12重量％的产物。
实施例2-制备水解产物方法根据下述方法制备水解产物1.离心沉降(centrifuge down)根据实施例1生产的2L生物量(ca.14g/L)，在上清中重悬为约250mL。
2.将所述生物量加温到80-95℃，15分钟。
3.冷却到65℃。
4.将pH调为5.505.加入56mg Nuclease RP-1。
6.温育2小时。
7.将温度降到50℃。
8.加入36mg Deamizyme 50000。
9.温育1小时。
10.加温到85℃，5分钟。
11.冷却到40-50℃。
12.UF过滤(最少50mL产物)。
13.分析所述产物的干物质含量，然后冻干。
14.分析所述冻干的产物5′-GMP，5′-IMP，N，OPA，灰分，脂肪，碳水化合物(anthron方法)含量。
结果分析所得产物并发现其具有下述特征化学组合物 干物质 94.0-98.0(每100g产物的g数)5′-GMP(HPLC) 5.0-7.55′-IMP(HPLC) 5.0-7.5MSG(酶法) 1.0-3.5氯化钠 0.0总氮(EA) 8.0-11.0蛋白质和核苷酸(N×6.25)50-63总碳水化合物(Anthrone) 10-20灰分(5501)10-15脂肪(EC，84/4/EEC) ＜0.1物理性质 溶解度 水中10％pH(10％溶液) 5.0-5.510％溶液颜色 棕色产物颜色 米黄色(beige)实施例3-制备水解产物方法根据下述方法制备水解产物1.离心沉降根据实施例1生产的2L生物量(ca.14g/L)并在上清中重悬为约250mL。
2.将所述生物量加温到80-95℃，15分钟。
3.冷却到65℃。
4.将pH调为5.505.加入56mg Nuclease RP-1。
6.温育2小时。
7.将温度降到50℃。
8.加入40mg Deamizyme 50000和252mg Flavourzyme。
9.温育16小时。
10.加温到85℃，5分钟。
11.冷却到40-50℃。
12.UF过滤(最少50mL产物)。
13.分析所述产物的干物质含量，然后冻干。
14.分析所述冻干的产物5′-GMP，5′-IMP，N，OPA，灰分，脂肪，碳水化合物(anthron方法)，和氨基酸组分。
结果分析所得产物并发现其具有下述特征化学组合物 干物质 94.0-98.0(每100g产物的g数)5′-GMP(HPLC) 2.5-3.55′-IMP(HPLC) 2.5-3.5MSG(酶法) 2.0-3.0氯化钠 0.0氨基氮(OPA) 4.0-5.0总氮(EA)10.0-12.0蛋白质和核苷酸(N×6.25) 63-75总碳水化合物(Anthrone) 8-14灰分(5501) 5-10脂肪(EC，84/4/EEC) ＜0.1氨基酸组合物 丙氨酸5.4 精氨酸4.1
(每100g产物的g数)天冬氨酸5.9 半胱氨酸0.5谷氨酸7.4 甘氨酸3.5组氨酸1.3 异亮氨酸2.8亮氨酸4.9 赖氨酸4.9蛋氨酸1.9 苯丙氨酸2.9脯氨酸3.3 丝氨酸2.3苏氨酸2.8 酪氨酸2.4色氨酸1.1 缬氨酸5.7物理性状 溶解度 水中10％pH(10％溶液)5.0-5.510％溶液颜色黄产物颜色浅米黄色
权利要求
1.生产饲料或饲料组分的方法，所述方法包含用酶法水解作用处理包含甲烷营养型细菌的微生物培养物。
2.生产饲料或饲料组分的方法，所述方法包含下述步骤(a)制备微生物培养物的水浆液，其包含甲烷营养型细菌可选与一或多种异养型细菌的组合；(b)可选加热所述浆液；并且(c)用酶法水解作用处理所得产物。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其还包含分离所述水解产物的步骤。
4.权利要求1到3任一的方法，其中所述培养物已经用甲烷作为碳源来生产。
5.权利要求1到4任一的方法，其中所述培养物在所述酶法水解作用之前用细胞裂解来处理。
6.权利要求5的方法，其中通过压力降低法来进行细胞裂解。
7.权利要求1到6任一的方法，其中所述酶法水解作用通过将所述培养物与核酸切割酶接触来进行。
8.权利要求1到7任一的方法，其中所述酶法水解作用通过将所述培养物与具有5′-腺苷脱氨酶活性的酶接触来进行。
9.权利要求1到8任一的方法，其中所述酶法水解作用通过将所述培养物与蛋白酶接触来进行。
10.权利要求1到9任一的方法，其中所述培养物包含荚膜甲基球菌。
11.权利要求1到10任一的方法，其中所述培养物还包含异养型细菌。
12.通过权利要求1到11任一的方法获得的水解产物。
13.衍生自含甲烷营养型细菌的生物量的水解产物，所述产物具有的核苷酸含量为10-20重量％(以干物质为基)。
14.权利要求13的产物，其具有的5′-核苷酸含量为4-15重量％(以干物质为基)。
15.权利要求12到14任一的水解物质或其加工衍生物，在饲料前体中或作为饲料前体的用途。
16.一种食品，其包含权利要求12到14任一的水解物质或其加工衍生物。
17.权利要求16的食品，其为狗食或向其加入的添加剂。
18.权利要求16的食品，其为鱼食。
19.权利要求18的食品，其为丸状可挤压的鱼食。
全文摘要
生产饲料或饲料组分，例如可口性提高制剂的方法，所述方法包含用酶法水解作用来处理包含甲烷营养型细菌的微生物培养物。
文档编号A23K1/00GK1642438SQ03806157
公开日2005年7月20日 申请日期2003年2月12日 优先权日2002年2月12日
发明者艾纳·莫恩, 亨里克·埃里克森, 简·拉森 申请人:诺弗姆公司