专利名称：番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种菌株，具体是涉及一种番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。
背景技术：
灰霉病是由半知菌亚门灰葡萄孢属(5Wo;/,、 Pers)真菌侵染所致，是一种世界性重
要病害。不仅对番茄的危害越来越重，而且目前已成为番茄、黄瓜、茄子、西葫芦、菜豆、 莴笋、生菜、韭菜等蔬菜的主要病害，目前在生产上对番茄灰霉病的防治主要依靠喷洒化学 农药，现在具有较高活性的新型化学农药主要有嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等。但若连续 使用化学药剂，病菌会逐渐产生了抗药性，防效逐年下降，而且化学农药影响番茄品质、污 染环境、影响人类健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含有化学农药的嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等成份、能对 治疗番茄灰霉病具有良好应用效果的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。其技术方案为
番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四个步骤步骤1从感染灰霉病的 土壤样品中筛选到一株拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，该细菌命名为B-04;步骤2培养含有 B-04细菌的菌液；步骤3依次用超纯水、lmMHepes、电击缓冲液洗；步骤4通过电击的方 法将e -1，3-葡聚糖酶基因转化到B-04细菌内，获得拮抗菌株B-04-glu。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步骤2中将单个B-04细菌菌落接种到LB培养 基中，于26 32'C摇床剧烈振荡培养6 20h,然后将生成的菌悬液与LB培养基按1: 10的 比例接种，再于26 32'C摇床剧烈振荡培养至对数生长期2 3.5h。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步骤3中将步骤2最终获得的菌液先冰浴20 40min，然后离心收集菌体，将收集的菌体依次用预冷的超纯水洗至少1 3次，用浓度为 lmM、 pH为7.0的Hepes洗1 3次，用浓度为lmM的Hepes、含甘油10%且pH为7.0 的电击缓冲液洗1 3次，然后悬浮到1.0 2.0ml电击缓冲液中，分装成每管10(Hi1，储藏于 -70"的冰箱中。
所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步骤4中电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，
3溶解后加入5 10^1质粒DNA，冰上放置2 10min后转移到电击转化杯中，电击条件为800 1800V、电容25 50uF、电阻100 400Q、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到500^1 1.5mlLB培养基中，在37。C培养0.5 24h后，取lOOpl菌液涂在含有相应抗生素的平板上， 于26 32'C培养6 24h，即获得拮抗菌株B-04-glu。所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu,以B-04为出发菌株，用e-l,3-葡聚糖酶基因构建 工程菌B-04-glu， e -1,3-葡聚糖酶基因从质粒pUC1940中酶切获得。其工作原理为B-04细菌本身有较强的抗番茄灰霉病的功能，e-i,3-葡聚糖酶又能导致 菌丝细胞壁破裂，原生质体外泄，从而杀死病原菌，因此通过电击的方法将P-l,3-葡聚糖酶 基因转化到B-04细菌内，获得的拮抗菌株B-04-glu与野生菌株相比，能大大提高了防治番 茄灰霉病的能力。本发明与现有技术相比，由于是生物防治，不含有化学农药的嘧啶胺类、吡咯类以及酰 胺类等成份，所以具有无毒、不污染环境、不易产生抗药性、无残留、易生产、持效期长、 治病力强、应用效果好、对非耙标生物安全等优点,具有广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1:步骤l:从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，即B-04细菌；步骤2:将单个B-04细菌落接种到LB培养基中，于3(TC摇床剧烈振荡培养20h，然后 将生成的菌悬液与LB培养基按1: IO的比例接种，再于30'C摇床剧烈振荡培养至对数中期 约3h;步骤3:将步骤2最终获得的菌液冰浴20min，离心收集菌体，将收集的菌体依次用预 冷的超纯水洗1次，用浓度为lmM、 pH为7.0的Hepes洗2次，用浓度为lmM的Hepes、 含甘油10%且pH为7.0的电击缓冲液洗2次，然后悬浮到1.5ml电击缓冲液中，分装成每 管10(^1，储藏于-7(TC的冰箱中；步骤4:电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入5^1质粒DNA，质粒DNA 为e-l,3-葡聚糖酶基因与质粒连接产物，冰上放置3min后转移到电击转化杯中，电击条件为 电压800V、电容50uF、电阻200Q、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到800nl LB培 养基中，在37。C培养45min后，取100pl菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于3(TC培养 10h，获得70个转化子拮抗菌株B-04-glu。实施例2:其步骤l同实施例l的步骤l;
步骤2:将单个B-04细菌落接种到LB培养基中，于28'C摇床剧烈振荡培养15h，然后 将生成的菌悬液与LB培养基按1: IO的比例接种，再于28'C摇床剧烈振荡培养至对数中期 约2.5h;
步骤3:将步骤2最终获得的菌液冰浴30min,离心收集菌体，将收集的菌体依次用预 冷的超纯水洗2次，用浓度为lmM、 pH为7.0的Hepes洗1次，用浓度为lmM的Hepes、 含甘油10%且pH为7.0的电击缓冲液洗2次，然后悬浮到1.5ml电击缓冲液中，分装成每 管10(Hil，储藏于-7(TC的冰箱中；
步骤4:电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入8pl质粒DNA，质粒DNA 为e-l,3-葡聚糖酶基因与质粒连接产物，冰上放置5min后转移到电击转化杯中，电击条件为 电压1200V、电容25uF、电阻400Q、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到800|il LB 培养基中，在37。C培养lh后，取10(^1菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于28。C培养15h， 获得600个转化子拮抗菌株B-04-gki。
实施例3:
其步骤l同实施例l的步骤l;
步骤2:将单个B-04细菌落接种到LB培养基中，于26X:摇床剧烈振荡培养10h，然后 将生成的菌悬液与LB培养基按1: IO的比例接种，再于26'C摇床剧烈振荡培养至对数中期 约2h;
步骤3:将步骤2最终获得的菌液冰浴40min，离心收集菌体，将收集的菌体依次用预 冷的超纯水洗2次，用浓度为lmM、 pH为7.0的Hepes洗2次，用浓度为lmM的Hepes、 含甘油10%且pH为7.0的电击缓冲液洗1次，然后悬浮到2.0ml电击缓冲液中，分装成每 管10(Hd，储藏于-7(TC的冰箱中；
步骤4:电击转化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入10nl质粒DNA，质粒DNA 为e-l,3-葡聚糖酶基因与质粒连接产物，冰上放置8min后转移到电击转化杯中，电击条件为 电压1400V、电容50uF、电阻200Q、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到800|al LB 培养基中，在37。C培养1.5h后，取lO(Hil菌液涂在含有相应抗生素的平板上，于26。C培养 20h，获得800个转化子拮抗菌株B-04-glu。
权利要求
1、一种番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四个步骤步骤1从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株高效拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，该细菌命名为B-04；步骤2培养含有B-04细菌的菌液；步骤3依次用超纯水、1mM Hepes、电击缓冲液洗；步骤4通过电击的方法将β-1，3-葡聚糖酶基因转化到B-04细菌内，获得拮抗菌株B-04-glu。
2、 如权利要求l所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于步骤2中，将单个 B-04细菌菌落接种到LB培养基中，于26 32t;摇床剧烈振荡培养6 20h，然后将生成的菌 悬液与LB培养基按1: IO的比例接种，再于26 32'C摇床剧烈振荡培养至对数生长期2 3.5h。
3、 如权利要求l所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于步骤3中，将步骤 2最终获得的菌液先冰浴20 40min，然后离心收集菌体，将收集的菌体依次用预冷的超纯 水洗至少1 3次，用浓度为lmM、 pH为7.0的Hepes洗1 3次，用浓度为lmM的Hepes、 含甘油10%且pH为7.0的电击缓冲液洗1 3次，然后悬浮到1.0 2.0ml电击缓冲液中，分 装成每管10(Hd，储藏于-7(TC的冰箱中。
4、 如权利要求l所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于步骤4中，电击转 化时取一管菌液放在冰上溶解，溶解后加入5 10nl质粒DNA，质粒DNA为e-l，3-葡聚糖 酶基因与质粒连接产物，冰上放置2 10min后转移到电击转化杯中，电击条件为800 1800V、电容25 50uF、电阻100 400Q、电击杯内径2mm，电击后将其菌液加入到500^1 L5mlLB培养基中，在37。C培养0.5 2h后，取菌液涂在含有相应抗生素的平板上， 于26 32-C培养6~24h，即获得拮抗菌株B-04-gki。
5、 如权利要求1所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于以B-04细菌为出 发菌株，用e -1，3-葡聚糖酶基因构建工程菌B-04-glu， e -1,3-葡聚糖酶基因从质粒pUC1940 中酶切获得。
全文摘要
本发明提供一种番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四个步骤步骤1从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株高效拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，该细菌命名为B-04；步骤2培养含有B-04细菌的菌液；步骤3依次用超纯水、1mM Hepes、电击缓冲液洗；步骤4通过电击的方法将β-1，3-葡聚糖酶基因转化到B-04细菌内，获得拮抗菌株B-04-glu。本发明由于是生物防治，不含有化学农药的嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等成份，所以具有无毒、不污染环境、不易产生抗药性、无残留、易生产、持效期长、治病力强、应用效果好、对非靶标生物安全等优点，具有广阔的应用前景。
文档编号A01N63/02GK101289649SQ200710014340
公开日2008年10月22日 申请日期2007年4月16日 优先权日2007年4月16日
发明者李桂霞, 马汇泉 申请人:山东理工大学