专利名称：生物膜形成抑制剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物膜形成抑制剂组合物，更具体来说，涉及抑制生物膜形成从而防止由生物膜造成的危害的生物膜形成抑制剂组合物，在微生物相关的各种领域中，上述生物膜由微生物和由微生物产生的物质所形成。
背景技术：
生物膜也被称为生物薄膜或粘液(slime)，通常是指由将其自身粘附在物质表面上并在含水体系中增殖的微生物在细胞内产生的聚合物质例如多糖、蛋白质和类似物形成的结构。当形成生物膜时，会发生由微生物造成的危害，并且产生各种工业问题。例如，当食品加工厂的管线内部形成生物膜时，这些生物膜脱落，导致外源物质掺入食品，来源于微生物的毒素还会导致食源性疾病。而且，金属表面上形成生物膜是金属腐蚀从而加速设备老化的原因。
另外，对于已经形成生物膜的微生物聚集物，与微生物处于分散并漂浮在含水体系中的状态下的情况相比较，在许多情况下诸如杀菌剂和抑菌剂的微生物防治剂不能发挥出足够的效果。例如，在医学领域，近年来对由存活在医疗设备的狭窄空隙或孔隙中的微生物形成的生物膜所引起的院内感染病例多有报道。众所周知的是在人体口腔中的牙齿上形成的生物膜，即所谓的牙斑(牙菌斑)，其是导致龋齿病或牙龈疾病的病因，因此对于这些问题已经进行了很长时间的研究。
因此，对于通过对微生物尤其是细菌发挥杀菌作用或抑菌作用从而抑制微生物生长，以便抑制生物膜的观点已经进行了广泛研究。专利文件1或专利文件2公开了以下内容通过使用脂肪酸或脂肪醇减少细菌细胞的数量，因此可避免细菌在目标物质上的粘附。具体来说，专利文件1显示，由抗菌剂油相和乳化剂制备的作为乳剂的组合物表现出在相对短的时间内减少细菌细胞数量的效应，因此其根据每单位体积细菌细胞的绝对数量减少的现象，公开了抑制细菌在目标物质的表面上粘附的观点。此外，专利文件3公开了其中非水活性成分如抗炎药物和类似物溶解在油性物质中的牙膏组合物和类似物，同时专利文件4公开了通过将污染生物(藤壶(barnacles)、细菌粘液或类似物)与特定的烷基胺衍生物接触来防止污染生物定居在水下结构上的方法，但两者都不能有效地抑制生物膜的形成。此外，专利文件5描述了使用聚乙二醇脂肪酸酯来抑制浸泡在水中的表面上的细菌粘附的方法，并且公开了以远低于表现出杀菌活性的阈值水平的聚乙二醇脂肪酸酯浓度能有效地抑制细菌粘附。专利文件6也公开了含有单脂肪酸聚甘油酯和类似物的工业防腐剂和抗真菌剂。
专利文件1或2描述了在将微生物与杀菌剂或抗微生物剂组合物接触60秒或更少的相对短的时间的情况下对杀菌特性的评价(将细菌细胞的数量减少大约4个数量级)。然而，由于生物膜的问题发生在数天至数月的长时间内，因此实际上从这种杀菌特性的短期评价很难得出控制抑制生物膜形成的结论。不能判定，其中提到的作为抗菌剂油相的脂肪酸或脂肪醇对于所有的微生物(细菌)都具有充分的杀菌效应，特别是对于经常通过形成生物膜产生问题的革兰氏阴性细菌，这些物质并不具有最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，MIC是长期杀菌效应的指标(Jon J.Kabara主编，Cosmetic and DrugPreservation；Principles and Practice，Fragrance Journal，Ltd.，1990)。而且，根据本发明的发明人进行的实验，专利文件1或专利文件2中所述的组合物如其中所述的那样，对革兰氏阴性细菌，尤其是假单胞菌属(Pseudomonas)或沙雷氏菌属(Serratia)显示有短期(至多大约3小时)的杀菌效应，但没有长期杀菌特性或甚至抑制微生物生长的长期抑菌效应(1天或更长时间)的指征，并证实最终有生物膜形成。
除这些以外，有一些具有高杀菌性的杀菌药物，其具有显示瞬时效应的特性，如具有高杀菌性的阳离子表面活性剂、次氯酸盐和类似物。然而，由于在体系中有机物质的存在下其杀菌性迅速消失，如上所述很难在很长的时间内保持降低微生物数量的效应。
出于这些原因，就细菌杀菌剂或抑菌剂而言，难以根本上抑制生物膜的形成。 JP-A-2002-524257(WO 00/15562)JP-A-2004-513153(WO 02/038181)JP-A-2005-289917JP-A-2004-525935(WO 02/076928)JP-A-(Hei)11-512720(WO 97/11912)JP-A-2003-160410
发明内容
本发明提供了一种生物膜形成抑制剂组合物，其包括组分(A) (A)选自式(1)和式(2)所代表的化合物的至少一种或多种化合物或其盐 [化学式1] R1O-(EO)p-H (1)
其中R1和R2可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；EO代表乙烯氧基基团；p代表0至5的整数；且m和n各自是平均累计摩尔数，m+n是0-30的数；和 (B)表面活性剂， 其中组分(A)和组分(B)的重量比(A)/(B)不大于2。
本发明还提供了通过将该生物膜形成抑制剂组合物与微生物接触来抑制生物膜形成的方法。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物作为生物膜形成抑制剂组合物的用途，该组合物包括下列组分(A) (A)选自式(1)和式(2)所代表的化合物的至少一种或多种化合物或其盐 [化学式2] R1O-(EO)p-H (1)
其中R1和R2可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；EO代表乙烯氧基基团；p代表0至5的整数；且m和n各自是平均累计摩尔数，m+n是0-30的数；和 (B)表面活性剂， 其中组分(A)和组分(B)的重量比(A)/(B)不大于2。
在再另一个方面，本发明提供了一种生物膜形成抑制剂组合物，其含有下列组分(C) (C)选自式(3)和式(4)所代表的化合物的至少一种或多种化合物 [化学式3] R3—SH (3)
其中R3和R4可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；且R5代表氢原子，或具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。
本发明还提供了通过将该生物膜形成抑制剂组合物与微生物接触来抑制生物膜形成的方法。
在另一个方面，本发明提供了下列组分(C)作为生物膜形成抑制剂的用途 (C)选自式(3)和式(4)所代表的化合物的至少一种或多种化合物 [化学式4] R3—SH(3)
其中R3和R4可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；且R5代表氢原子，或具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。
具体实施例方式 本发明提供了生物膜形成抑制剂组合物、抑制生物膜形成的方法，和该组合物作为生物膜形成抑制剂的用途。
根据本发明，可以长时间地抑制生物膜的形成。
对于组分(A)的式(1)，R1所代表的烷基或烯基可以是直链或支链，并且就生物膜形成抑制效应而言，其优选具有10-12个碳原子。EO所代表的乙烯氧基基团的数目p，就生物膜形成抑制效应而言优选为0-4，且更优选为0-3，就对水的分散性而言，p优选为1-3。
对于组分(A)的式(2)，R2所代表的烷基或烯基可以是直链或支链，并且优选具有10-12个碳原子。EO所代表的乙烯氧基基团的数目，即m+n，优选为0-15，且更优选0-5。式(2)所代表的化合物的盐的实例，包括矿物酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐和类似物，和有机酸盐，如乙酸盐、柠檬酸盐和类似物。
对于组分(C)的式(3)，R3所代表的烷基或烯基可以是直链或支链，并且优选具有10-12个碳原子。
对于组分(C)的式(4)，R4所代表的烷基或烯基可以是直链或支链，并且优选具有10-12个碳原子。对于R5的烷基基团，还特别优选具有1或2个碳原子的烷基基团。
本发明的组分(A)或组分(C)可以1ppm或更大的重量浓度存在于体系中，以较好地显示长期生物膜形成抑制效应，就经济效率和效果而言，优选1-10,000ppm，更优选5-10,000ppm，再更优选5-2,000ppm，再更优选10-1,000ppm。
由于式(1)或式(2)所代表的本发明的组分(A)的化合物疏水性高，且在水中的溶解性低，因此可以通过使用组分(B)的表面活性剂使目的试剂稳定地存在于含水体系中，从而在含水体系中更有效地使用目的试剂。式(3)或式(4)所代表的组分(C)的化合物本身显示出优异的生物膜形成抑制效应，但也可以通过使用组分(B)的表面活性剂使目的试剂更稳定地存在于含水体系中，从而在含水体系中更有效地使用目的试剂。
在此，短语“稳定地存在于含水体系中”是指组分(A)或组分(C)被乳化、分散或溶解且长期不会分离，每单位体积的含水体系可以乳化、分散或溶解大量的组分(A)或组分(C)的状态。
可用于本发明的生物膜形成抑制剂组合物的组分(B)的表面活性剂的类型不受具体限定，但优选能够使组分(A)或组分(C)稳定地存在于含水体系中的表面活性剂。特别是就乳化、分散或溶解的能力而言，在这些表面活性剂当中，优选使用阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。
阴离子表面活性剂的实例包括木质素磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基磺酸盐、聚氧乙烯(下文称作POE)烷基磺酸盐、POE烷基苯基醚磺酸盐、POE烷基苯基醚磷酸酯盐、POE芳基苯基醚磺酸盐、烷基硫酸酯盐、POE烷基硫酸酯盐、POE芳基苯基醚磷酸酯盐、萘磺酸盐、萘磺酸福尔马林缩合物、POE三苄基苯基醚磺酸盐、烷基磷酸盐、POE烷基磷酸盐、POE三苄基苯基醚磷酸酯盐、二烷基硫代琥珀酸盐、脂肪酸盐(皂)、POE烷基醚乙酸盐和类似物。其中，优选使用烷基磺酸酯盐、POE烷基磺酸酯盐或POE烷基醚乙酸盐。这些阴离子表面活性剂的烷基部分中碳原子的数目优选为10-18，且环氧乙烷的平均累计摩尔数优选为0-10，且更优选0-5。
非离子表面活性剂的实例包括单价醇衍生物型非离子表面活性剂，例如POE烷基醚(条件是排除组分(A))、POE烷基苯基醚、聚氧丙烯-POE(嵌段或无规)烷基醚、POE芳基苯基醚、POE苯乙烯化苯基醚、POE三苄基苯基醚和类似物；多元醇衍生物型非离子表面活性剂，例如脂肪酸(聚)甘油酯、脂肪酸蔗糖酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、POE脱水山梨糖醇脂肪酸酯、烷基葡糖苷(alkylpolyglycoside)和类似物；其中优选POE烷基醚(条件是排除组分(A))、脂肪酸(聚)甘油酯、烷基葡糖苷、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和POE脱水山梨糖醇脂肪酸酯，特别优选POE烷基醚(条件是排除组分(A))。此外，POE烷基醚的HLB值更优选为10或更大。POE烷基醚的烷基部分中碳原子的数目优选为12-18，且氧化乙烯的平均累计摩尔数尤其为6或更大。
组分(B)的表面活性剂可以单独使用，或者两种或多种物种组合使用，以进一步提高乳化、分散或溶解活性成分的能力。
在生物膜形成抑制剂组合物中，就长期的生物膜抑制效应而言，组分(A)或(C)与组分(B)的重量比(A)/(B)或(C)/(B)，优选为2/1至1/100，更优选2/1至1/50，再更优选2/1至1/20，再更优选1/1至1/10。而且，在使用式(1)和/或式(2)的组分的情况下，就长期的生物膜形成抑制效应而言，(A)/(B)比为2或更小。
此外，生物膜形成抑制剂组合物优选含有0.01-10wt％、更优选0.1-10wt％、再更优选0.5-5wt％的组分(A)或组分(C)，且优选含有0.1-30wt％、更优选1-20wt％的组分(B)。
本发明的生物膜形成抑制剂组合物可以与杀菌剂或抗微生物剂组合使用。通常，当形成生物膜时，会发生杀菌剂难以发挥效应的情况。然而，当生物膜形成被本发明的生物膜形成抑制剂组合物抑制时，便可以充分发挥杀菌剂的功效。
如上所述的杀菌剂或抗微生物剂的实例可以是季盐，例如氯化苯甲羟铵(benzalkonium chloride)、氯化苯甲乙氧铵(benzethoniumchjloride)、二癸基二甲基氯化铵、氯化十六烷基吡啶、盐酸洗必太和类似物；洗必太葡糖酸盐、盐酸聚六亚甲基双胍、三氯生(triclosan)、异丙基甲酚、三氯碳酰苯胺(trichlorocarbanilide)、乙醇、异丙醇或类似物。
本发明的生物膜形成抑制剂组合物也可以含有增稠剂，以增加组合物的粘度，并提高与目标物质的粘附性。
此外，本发明的生物膜形成抑制剂组合物中可以加入有螯合剂。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、琥珀酸、水杨酸、草酸、苹果酸、乳酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、葡糖酸、三聚磷酸、1-羟基乙烷-1，1-二膦酸、聚丙烯酸、丙烯酸/马来酸共聚物及其盐。
本发明的生物膜形成抑制剂组合物可以根据应用采用各种形式，例如液体、糊剂、散剂、片剂和类似形式。根据应用，生物膜形成抑制剂组合物可以作为含有所有组分作为混合物的单一剂型使用，但也可以是若干分次包装的形式。
本发明的生物膜形成抑制剂组合物可以有效地用作水稀释系统。收集一定量的该组合物的水稀释液，将目标物质浸泡其中。在广泛存在目标物质的情况下，可以使用喷雾器将该组合物作为雾来喷射，或者可以使用泡沫发生器将该组合物作为泡沫喷射。该组合物也可以倾注在目标物质上，或者可以用刷子或类似物涂于其上。除这些以外，可以将毛巾或类似物用该组合物的水稀释液浸泡，并用来擦拭目标物质。只要满足将该组合物与微生物接触的条件，该组合物的水稀释液可以附着或被涂抹在微生物可能存在的表面上。对于该组合物的水稀释液，使用时组分(A)或组分(C)的浓度按重量计优选为1-10,000ppm，且更优选为5-10,000ppm。
对于一些目标物质，也可以将该组合物作为乳膏或软膏涂抹和敷施，而不用将该组合物在水中稀释。在这种情况下，组分(A)或组分(C)以溶解、分散或乳化在合适溶剂中的形式提供，并且使用时组分(A)或组分(C)的浓度按重量计优选为1-10,000ppm，且更优选为5-10,000ppm。
本发明还提供了通过将该生物膜形成抑制剂组合物与微生物接触来抑制生物膜形成的方法。在此，需要连续进行生物膜形成抑制剂组合物和微生物之间的接触。本发明还提供了组分(A)或组分(C)作为生物膜形成抑制剂的用途。
本发明的生物膜形成抑制剂组合物可以用于其中生物膜的危害是受关注的问题的大量应用中。例如，该组合物可以应用于食品或饮料加工厂用的去污剂，在食品或饮料加工厂中微生物污染的危险很高。而且，该组合物也可以应用于医疗设备用去污剂，医疗设备易于形成生物膜，诸如，例如，内窥镜、人工透析仪和类似设备。此外，就高度安全性而言，该组合物也可以用于人用的清洁剂、牙膏、口腔护理产品、假牙护理产品和类似产品。
下面的实施例进一步描述和证明本发明的实施方式。给出的实施例仅为了进行说明，而不应当理解成是对本发明的限定。
具体实施例方式 (1)使用式(1)所代表的化合物的实例 实施例1生物膜形成抑制剂组合物的混合，以及抑制生物膜形成的能力的验证 组分(A)R1O-(EO)p-H (A-1)C8醇[KALCOL 0898，Kao Corporation制造，R1＝C8烷基，p＝0] (A-2)C10醇[KALCOL 1098，Kao Corporation制造，R1＝C10烷基，p＝0] (A-3)C12醇[KALCOL 2098，Kao Corporation制造，R1＝C12烷基，p＝0] (A-4)C14醇[KALCOL 4098，Kao Corporation制造，R1＝C14烷基，p＝0] (A-5)C12醇和1摩尔环氧乙烷的加合物[NIKKOL BL-1SY，Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造，R1＝C12烷基，p＝1] (A-6)C12醇和2摩尔环氧乙烷的加合物[NIKKOL BL-2SY，Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造，R1＝C12烷基，p＝2] (A-7)C12醇和3摩尔环氧乙烷的加合物[NIKKOL BL-3SY，Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造，R1＝C12烷基，p＝3] (A-8)C12醇和5摩尔环氧乙烷的加合物[NIKKOL BL-5SY，Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造，R1＝C12烷基，p＝5] (A-9)C12醇[反-2-十二烯-1-醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R＝C12烯基，p＝0] (A-10)C12醇(仲)[2-十二烷醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R1＝C12仲烷基，p＝0] (A-11)C12支链醇[2-丁基-1-辛醇，Sigma-Aldrich，Inc.制造，R1＝C12支链烷基，p＝0] 组分(A′)R1′O-(EO)p-H (A′-1)C1醇[甲醇，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R1′＝C1烷基，p＝0] (A′-2)C2醇[乙醇，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R1′＝C2烷基，p＝0] (A′-3)C3醇[1-丙醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R1′＝C3烷基，p＝0] (A′-4)C4醇[1-丁醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R1′＝C4烷基，p＝0] (A′-5)C16醇[KALCOL6098，Kao Corporation制造，R1′＝C16烷基，p＝0] (A′-6)C18醇[KALCOL8098，Kao Corporation制造，R1′＝C18烷基，p＝0] (A′-7)C1醇和1摩尔环氧乙烷的加合物[2-甲氧基乙醇，Wako PureChemical Industries，Ltd.制造，R1′＝C1烷基，p＝1] (A′-8)C1醇和2摩尔环氧乙烷的加合物[2-(2-甲氧基乙氧基)乙醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R1′＝C1烷基，p＝2] (A′-9)C2醇和1摩尔环氧乙烷的加合物[2-乙氧基乙醇，WakoPure Chemical Industries，Ltd.制造，R1′＝C2烷基，p＝1] (A′-10)C2醇和2摩尔环氧乙烷的加合物[2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R1′＝C2烷基，p＝2] (A′-11)C4醇和1摩尔环氧乙烷的加合物[2-丁氧基乙醇，WakoPure Chemical Industries，Ltd.制造，R1′＝C4烷基，p＝1] (A′-12)C4醇和2摩尔环氧乙烷的加合物[2-(2-丁氧基乙氧基)乙醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R1′＝C4烷基，p＝2] (A′-13)C20支链醇[2-辛基-1-十二烷醇，Sigma-Aldrich，Inc.制造，R1′＝C20支链烷基，p＝0] (A′-14)C12醇和8摩尔环氧乙烷的加合物[NIKKOL BL-8SY，Nikko Chemicals，Ltd.制造，R1′＝C12烷基，p＝8] 组分(B)表面活性剂[括号内的数字代表环氧乙烷的平均累计摩尔数。] <阴离子表面活性剂> (B-1)月桂基硫酸钠[EMAL 0，Kao Corporation制造] (B-2)聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸钠[EMAL 20C，Kao Corporation制造；活性成分25wt％] (B-3)聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸钠[KAO AKYPO RLM45-NV，Kao Corporation制造；活性成分24wt％] <非离子表面活性剂> (B-4)聚氧乙烯(6)月桂基醚[EMULGEN 106，Kao Corporation制造] (B-5)聚氧乙烯(12)月桂基醚[EMULGEN 120，Kao Corporation制造] (B-6)月桂基葡糖苷[MYDOL 12，Kao Corporation制造] (B-7)单辛酸癸基甘油酯[SY-GLYSTER MCA 750，SAKAMOTOYAKUHIN KOGYO CO.，LTD.制造] (B-8)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLSP-L10，KaoCorporation制造] (B-9)聚氧乙烯(6)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L106，Kao Corporation制造] (B-10)聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L120，Kao Corporation制造] 以重量计将各活性成分混合，使得组分(A)或组分(A′)的浓度固定在1wt％，同时组分(B)的浓度选自1wt％、3wt％、6wt％和10wt％，余量为离子交换水。将混料用Mueller-Hinton肉汤[Nippon BectonDickinson Co.，Ltd.制造]稀释至组分(A)或组分(A′)的浓度为100ppm，并取2mL稀释液，置于24-孔微量培养板[ASAHI TECHNO GLASSCORPORATION制造]中。
将假单胞菌(绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NBRC13275)、沙雷氏菌(粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)NBRC 12648)和克雷白杆菌(肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 13883)各自使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时，以形成集落。使用无菌竹签从形成的集落中取小量细菌集落接种在微量培养板上的各种上述检测溶液中。将接种溶液在37℃下孵育48小时，然后弃去培养溶液，通过肉眼评价观察粘附在微量培养板壁上的生物膜形成的状态。将生物膜形成状态分级，使得其中生物膜覆盖培养板壁表面的0-小于20％的状态定为A级，其中生物膜覆盖20％或更多-小于40％的状态定为B级，其中生物膜覆盖40％或更多-小于60％的状态定为C级，其中生物膜覆盖60％或更多的状态定为D级。
结果显示在表1-1至表1-5中。
[表1-5](续) 实施例2减少大容量塑料杯中生物膜产生的实验 将假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基；Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时。将在培养基中生长的集落刮除，并悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)中。得到的混悬液通过以5,000xg在10℃下离心15分钟离心两次进行洗涤，然后再次悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，制备细菌混悬液，在该混悬液中细菌浓度被调节至600nm处的吸光度为1.0(OD600＝1.0)。此后，将100mLMueller-Hinton肉汤[Nippon Becton Dickinson，Co.，Ltd.制造]和选自实施例1的15种检测药物的每一种均导入200-mL无菌旋盖杯(screwcup)[EIKENKIZAI CO.，LTD.制造]中并充分混合。组分(A)或组分(A′)的浓度调节至5ppm、10ppm、50ppm、100ppm或500ppm，然后将0.1mL如上所述制备的细菌混悬液接种至其中。而且，同时提供作为对照的检测部分，在对照中细菌如上所述接种在没有添加药物的Mueller-Hinton肉汤中。
将这些样品在37℃下静置培养，并在开始培养后的指定时间点1天、2天、3天和5天时，测量细菌细胞的数量，并通过肉眼评价观察杯内形成的生物膜。随后，培养溶液在5℃下以10,000xg离心30分钟，并分别去掉沉淀，在真空干燥器中干燥24小时，称重，由此测量的重量作为培养溶液中产生的生物膜的重量。而且，对生物膜形成的状态进行分级，使得其中确认杯中没有生物膜的状态定为A级；其中杯内在气-液界面处开始形成生物膜的状态定为B级，其中生物膜的形成从气-液界面向下延伸至培养溶液的状态定为C级。
结果显示在表2-1-1至表2-4-5中。
实施例3抑制硅酮(silicone)试管中生物膜形成的实验 将假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)和克雷白杆菌(肺炎克雷白杆菌ATCC 13883)使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时。将实施例1中使用的实施例产品9、实施例产品14和实施例产品30以及比较产品3和比较产品26分别稀释在1L Mueller-Hinton肉汤[Nippon BectonDickinson，Co.，Ltd.制造]中，使得组分(A)或组分(A′)的浓度为25ppm或100ppm。将上述琼脂培养基上细菌集落的环(loop)接种到每种稀释液中，并使用Cole-Parmer Instrument Company制造的Masterflex定量泵系统(系统型号No.7553-80，Head No.7016-21)，使悬浮有细菌的培养溶液在ARAM CORPORATION制造的硅酮试管(内径5mm，外径7mm)中在37℃下进行循环。而且，培养溶液的循环以50-60mL/min的流速进行。另外，同时提供作为对照的检测部分，其中细菌接种在没有添加药物的Mueller-Hinton肉汤中。
通过肉眼评价观察硅酮试管内的生物膜形成，同时，测量培养溶液中细菌细胞的数量。对生物膜形成的状态进行定级，使得其中没有生物膜形成的状态定为A级，其中开始有生物膜形成、硅酮试管的表面上有轻微着色的状态定为B级，其中生物膜形成明显的状态定为C级。
结果显示在表3-1-1至表3-2-3中。表3-1-1至表3-1-3显示了使用假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)得到的结果，而表3-2-1至表3-2-3显示了使用克雷白杆菌(肺炎克雷白杆菌ATCC 13883)得到的结果。
[表3-1-2]
[表3-2-2] 肺炎克雷白杆菌ATCC 13883
在使用根据本发明的产品的情况下，证实硅酮试管中的生物膜形成可以受到显著抑制。就同时检测的培养溶液中细菌细胞数量的测量值而言，对照、实施例产品和比较产品均引起了细菌生长。因此，认为生物膜的形成不是被杀菌或抗微生物作用抑制的。
实施例4验证醇或醇和环氧乙烷的加合物，和表面活性剂的组合抑制生物膜形成的能力和杀菌力 使用化合物(A-2)、(A-3)和(A-7)作为组分(A)，组分(B-1)、(B-5)、(B-11)和(B-12)作为组分(B)，如表4中所示，制备实施例产品47-54和比较产品31-34的组合物。
假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基；Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时。将在培养基中生长的集落刮除，并悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中。得到的混悬液通过以5,000xg在10℃下离心15分钟离心两次进行洗涤，然后再次悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中以制备细菌混悬液，该混悬液中细菌浓度被调节至600nm处的吸光度为1.0(OD600＝1.0)。此后，将99mL Mueller-Hinton肉汤[Nippon Becton Dickinson，Co.，Ltd.制造]引入200-mL无菌旋盖杯[EIKENKIZAI CO.，LTD.制造]中，同时，将1mL每种已制备的生物膜形成抑制剂组合物加入其中，将杯中的内容物充分混合。组分(A)的浓度调节至150ppm，然后将0.1mL如上所述制备的细菌混悬液接种至其中。
组分(A) (A-2)C10醇[KALCOL 1098，Kao Corporation制造] (A-3)C12醇[KALCOL 2098，Kao Corporation制造] (A-7)C12醇和3摩尔环氧乙烷的加合物(NIKKOL BL-3SY，Nikko Chemicals，Ltd.制造，R′＝C12烷基，p＝3) 组分(B)表面活性剂[括号内的数字代表环氧乙烷的平均累计摩尔数] (B-1)月桂基硫酸钠[EMAL 0，Kao Corporation制造] (B-5)聚氧乙烯(12)月桂基醚[EMULGEN 120，Kao Corporation制造] (B-11)聚氧乙烯(10)油酸酯[EMANON 4110，Kao Corporation制造] (B-12)聚氧乙烯(25)氢化蓖麻油[EMANON CH25，KaoCorporation制造] 使用这些培养溶液，在37℃下开始静置培养。之后紧接着，以及在与生物膜形成抑制剂接触后3小时和24小时的指定时间点，测量每种培养溶液中的细菌细胞数量，并且在开始培养后12小时和24小时的时候，将每种培养溶液以10,000xg在5℃下离心30分钟。去除沉淀，在真空干燥器中干燥24小时，并称重，由此测量到的重量作为培养溶液中生成的生物膜的重量。
结果显示在表4中。
[表4](续)
*Log10CFU/mL 如表4所示，发现当组分(A)和组分(B)的比例设在2或更小、优选1/1-1/10时，长期抑制生物膜形成的效应非常明显(实施例产品47-54)，但组分(B)的量较小的组合物(比例(A)/(B)为2.5，比较产品33)或仅有组分(B)的组合物(比较产品32、比较产品34)不显示任何的生物膜形成抑制效应。
似乎还表明，在杀菌效应和生物膜形成抑制效应之间并没有相关性。
(2)使用式(2)所代表的化合物的实例 实施例5生物膜形成抑制剂组合物的混合，以及抑制生物膜形成的能力的验证 组分(A)[式(2)EO代表乙烯氧基基团，且m和n各自代表平均累计摩尔数] [化学式5]
(A-21)C8胺[FARMIN 08D，Kao Corporation制造，R2＝C8烷基，m+n＝0] (A-22)C10胺[癸胺，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R2＝C10烷基，m+n＝0] (A-23)C12胺[FARMIN 20D，Kao Corporation制造，R2＝C12烷基，m+n＝0] (A-24)C12胺盐酸盐[十二烷胺盐酸盐，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R2＝C12，m+n＝0] (A-25)椰子胺(cocoamine)[FARMIN CS，Kao Corporation制造，R2＝C8-14烷基(椰子组合物)，m+n＝0] (A-26)椰子胺乙酸酯[ACETAMIN 24，Kao Corporation制造，R2＝C8-14烷基(椰子组合物)，m+n＝0] (A-27)椰子胺和2摩尔环氧乙烷的加合物[AMIET 102，KaoCorporation制造，R2＝C8-14烷基(椰子组合物)，m+n＝2] (A-28)椰子胺和5摩尔环氧乙烷的加合物[AMIET 105，KaoCorporation制造，R2＝C8-14烷基(椰子组合物)，m+n＝5] 组分(A′)[式(2)EO代表乙烯氧基基团，且m和n各自代表平均累计摩尔数] [化学式6]
(A′-21)C3胺[丙胺，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R2′＝C3烷基，m+n＝0] (A′-22)盐酸C3胺[盐酸丙胺，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R2′＝C3烷基，m+n＝0] (A′-23)C6胺[己胺，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R2′＝C6烷基，m+n＝0] (A′-24)盐酸C6胺[盐酸己胺，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R2′＝C6烷基，m+n＝0] (A′-25)氢化牛脂胺(tallow amine)[FARMIN86T，Kao Corporation制造，R2′＝C16，C18烷基，m+n＝0] (A′-26)C18胺[FARMIN 80V，Kao Corporation制造，R2′＝C18烷基，m+n＝0] (A′-27)油胺(oleylamine)[FARMIN O，Kao Corporation制造，R2′＝C18烯基，m+n＝0] (A′-28)氢化牛脂胺和2摩尔环氧乙烷的加合物[AMIET 302，Kao Corporation制造，R2′＝C16，C18烷基，m+n＝2] (A′-29)氢化牛脂胺和20摩尔环氧乙烷的加合物[AMIET 320，Kao Corporation制造，R2′＝C16，C18烷基，m+n＝20] 组分(B)表面活性剂[括号内的数字代表氧化乙烯的平均累计摩尔数] <阴离子表面活性剂> (B-1)月桂基硫酸钠[EMAL 0，Kao Corporation制造] (B-2)聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸钠[EMAL 20C，Kao Corporation制造；活性成分25wt％] (B-3)聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸钠[KAO AKYPO RLM45-NV，Kao Corporation制造；活性成分24wt％] <非离子表面活性剂> (B-4)聚氧乙烯(6)月桂基醚[EMULGEN 106，Kao Corporation制造] (B-5)聚氧乙烯(12)月桂基醚[EMULGEN 120，Kao Corporation制造] (B-6)月桂基葡糖苷[MYDOL 12，Kao Corporation制造] (B-7)单辛酸癸基甘油酯[SY-GLYSTER MCA750，SAKAMOTOYAKUHIN KOGYO CO.，LTD.制造] (B-8)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLSP-L10，KaoCorporation制造] (B-9)聚氧乙烯(6)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L106，Kao Corporation制造] (B-10)聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L120，Kao Corporation制造] 活性成分基于重量进行混合，使得组分(A)或组分(A′)的浓度固定在1wt％，而组分(B)的浓度选自1wt％、3wt％、6wt％和10wt％，余量为离子交换水。使用Mueller-Hinton肉汤[Nippon Becton DickinsonCo.，Ltd.制造]将混合物稀释至组分(A)或组分(A′)的浓度为100ppm。取2mL量的稀释液，并将其置于24-孔微量培养板[ASAHI TECHNOGLASS CORPORATION制造]中。
假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)、沙雷氏菌(粘质沙雷氏菌NBRC 12648)和克雷白杆菌(肺炎克雷白杆菌ATCC 13883)各自使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时，以形成集落。使用无菌竹签从形成的集落中取小量细菌集落接种在微量培养板上的每种上述检测溶液中。将接种溶液在37℃下孵育48小时，然后弃去培养溶液，通过肉眼评价观察粘附在微量培养板上的生物膜形成的状态。将生物膜形成的状态分级，使得其中生物膜覆盖培养板壁表面的0-小于20％的状态定为A级，其中生物膜覆盖壁表面的20％或更多-小于40％的状态定为B级，其中生物膜覆盖壁表面的40％或更多-小于60％的状态定为C级，以及其中生物膜覆盖壁表面的60％或更多的状态定为D级。
结果显示在表5-1至表5-4中。
实施例6减少大容量塑料杯中生物膜生成的实验 假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基；Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时。将在培养基中生长的集落刮除，并悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，然后将混悬液通过以5,000xg在10℃下离心15分钟离心两次进行洗涤。得到的沉淀物再次悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，以制备细菌混悬液，该混悬液中的细菌浓度调节至600nm处的吸光度为1.0(OD600＝1.0)。此后，将100mLMueller-Hinton肉汤[Nippon Becton Dickinson，Co.，Ltd.制造]和选自实施例5的15种检测药物的每一种引入到200-mL无菌旋盖杯[EIKENKIZAI CO.，LTD.制造]中，并充分混合。组分(A)或组分(A′)的浓度调节至5ppm、10ppm、50ppm、100ppm或500ppm，然后将0.1mL如上所述制备的细菌混悬液接种至其中。而且，同时提供作为对照的检测部分，在对照中细菌如上所述接种在没有添加药物的Mueller-Hinton肉汤中。
将这些样品在37℃下静置培养，并在开始培养后的指定时间点1天、2天、3天和5天时，测量培养溶液中细菌细胞的数量，并通过肉眼评价观察杯内形成的生物膜。随后，将培养溶液在5℃下以10,000xg离心30分钟，去掉沉淀，在真空干燥器中干燥24小时，并称重，由此测量的重量作为培养溶液中产生的生物膜的重量。而且，对生物膜形成的状态进行分级，使得其中确认杯中没有生物膜的状态定为A级；其中杯内在气-液界面处开始形成生物膜的状态定为B级，其中生物膜的形成从气-液界面向下延伸至培养溶液的状态定为C级。
结果显示在表6-1-1至表6-3-5中。
从上述结果发现，采用式(2)所代表的化合物的实施例产品可以有效地抑制生物膜的形成。
(3)使用式(3)所代表的化合物的实例 实施例7生物膜形成抑制剂组合物的混合，和抑制生物膜形成的能力的验证 组分(C)R3-SH (C-31)C8硫醇[1-辛硫醇，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R3＝C8烷基] (C-32)C10硫醇[1-癸硫醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R3＝C10烷基] (C-33)C12硫醇[THIOKALCOL 20，Kao Corporation制造，R3＝C12烷基] (C-34)C12硫醇(叔)[叔十二硫醇，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R3＝C12叔烷基] 组分(C′)R3′-SH (C′-31)C3硫醇[1-丙硫醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R3′＝C3烷基] (C′-32)C3硫醇(仲)[2-丙硫醇，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R3′＝C3烷基] (C′-33)C6硫醇[1-己硫醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R3′＝C6烷基] (C′-34)C16硫醇[1-十六硫醇，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R3′＝C16烷基] (C′-35)C18硫醇[1-十八硫醇，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R3′＝C18烷基] 组分(B)表面活性剂[括号内的数目代表环氧乙烷的平均累计摩尔数] <阴离子表面活性剂> (B-1)月桂基硫酸钠[EMAL 0，Kao Corporation制造] (B-2)聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸钠[EMAL 20C，Kao Corporation制造；活性成分25wt％] (B-3)聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸钠[KAO AKYPO RLM45-NV，Kao Corporation制造；活性成分24wt％] <非离子表面活性剂> (B-4)聚氧乙烯(6)月桂基醚[EMULGEN 106，Kao Corporation制造] (B-5)聚氧乙烯(12)月桂基醚[EMULGEN 120，Kao Corporation制造] (B-6)月桂基葡糖苷[MYDOL 12，Kao Corporation制造] (B-7)单辛酸癸基甘油酯[SY-GLYSTER MCA750，SAKAMOTOYAKUHIN KOGYO CO.，LTD.制造] (B-8)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOL SP-L10，KaoCorporation制造] (B-9)聚氧乙烯(6)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L106，Kao Corporation制造] (B-10)聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L120，Kao Corporation制造] 以重量计将各活性成分混合，使得组分(C)或组分(C′)的浓度固定在1wt％，同时组分(B)的浓度选自1wt％、3wt％、6wt％和10wt％，余量为离子交换水。混料使用Mueller-Hinton肉汤[Nippon BectonDickinson Co.，Ltd.制造]稀释至组分(C)或组分(C′)的浓度为100ppm。取2mL稀释液，并置于24-孔微量培养板[ASAHI TECHNO GLASSCORPORATION制造]中。
假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)、沙雷氏菌(粘质沙雷氏菌NBRC 12648)和克雷白杆菌(肺炎克雷白杆菌ATCC 13883)各自使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时，以形成集落。使用无菌竹签从形成的集落中取小量细菌集落接种在微量培养板上的每种上述检测溶液中。将接种溶液在37℃下孵育48小时，然后弃去培养溶液，通过肉眼评价观察粘附在微量培养板上的生物膜形成的状态。将生物膜形成的状态分级，使得其中生物膜覆盖培养板壁表面的0-小于20％的状态定为A级，其中生物膜覆盖壁表面的20％或更多-小于40％的状态定为B级，其中生物膜覆盖壁表面的40％或更多-小于60％的状态定为C级，其中生物膜覆盖壁表面的60％或更多的状态定为D级。
结果显示在表7-1至表7-2中。
实施例8减少大容量塑料杯中生物膜产生的实验 假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基；Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时。将在培养基中生长的集落刮除，并悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，然后将该混悬液通过以5,000xg在10℃下离心15分钟离心两次进行洗涤。得到的沉淀物再次悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，以制备细菌混悬液，该混悬液中的细菌浓度调节至600nm处的吸光度为1.0(OD600＝1.0)。此后，将100mLMueller-Hinton肉汤[Nippon Becton Dickinson，Co.，Ltd.制造]和选自实施例7的15种检测药物的每种引入200-mL无菌旋盖杯[EIKENKIZAICO.，LTD.制造]中，并充分混合。组分(C)或组分(C′)的浓度调节至5ppm、10ppm、50ppm、100ppm或500ppm，然后将0.1mL如上所述制备的细菌混悬液接种至其中。而且，同时提供作为对照的检测部分，在对照中细菌如上所述接种在没有添加药物的Mueller-Hinton肉汤中。
将这些样品在37℃下静置培养，并在开始培养后的指定时间点1天、2天、3天和5天时，测量培养溶液中细菌细胞的数量，并通过肉眼评价观察杯内形成的生物膜。随后，培养溶液在5℃下以10,000xg离心30分钟，并去掉沉淀，在真空干燥器中干燥24小时，并称重，由此测量的重量作为培养溶液中产生的生物膜的重量。而且，对生物膜形成的状态进行分级，使得其中确认杯中没有生物膜的状态定为A级；其中杯内在气-液界面处开始形成生物膜的状态定为B级，其中生物膜的形成从气-液界面向下延伸至培养溶液的状态定为C级。
结果显示在表8-1-1至表8-2-5中。
[表8-1-1]
从上述结果发现，含有式(3)所代表的化合物的实施例产品可有效地长期抑制生物膜形成。
(4)使用式(4)所代表的化合物的实例 实施例9生物膜形成抑制剂组合物的混合，以及抑制生物膜形成的能力的验证 组分(C)R4O-CO-CH3 (C-41)C8醇-乙酸酯[乙酸辛酯，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R4＝C8烷基] (C-42)C10醇-乙酸酯[乙酸癸酯，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R4＝C10烷基] (C-43)C12醇-乙酸酯[乙酸十二酯，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R4＝C12烷基] 组分(C′)R4′O-CO-CH3 (C′-41)C2醇-乙酸酯[乙酸乙酯，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R4′＝C2烷基] (C′-42)C4醇-乙酸酯[乙酸丁酯，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R4′＝C4烷基] (C′-43)C6醇-乙酸酯[乙酸己酯，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，R4′＝C6烷基] (C′-44)C16醇-乙酸酯[乙酸十六酯，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R4′＝C16烷基] (C′-45)C18醇-乙酸酯[乙酸十八酯，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造，R4′＝C18烷基] 组分(B)表面活性剂[括号中的数字代表氧化乙烯的平均累计摩尔数] <阴离子表面活性剂> (B-1)月桂基硫酸钠[EMAL 0，Kao Corporation制造] (B-2)聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸钠[EMAL 20C，Kao Corporation制造；活性成分25wt％] (B-3)聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸钠[KAO AKYPO RLM45-NV，Kao Corporation制造；活性成分24wt％] <非离子表面活性剂> (B-4)聚氧乙烯(6)月桂基醚[EMULGEN 106，Kao Corporation制造] (B-5)聚氧乙烯(12)月桂基醚[EMULGEN 120，Kao Corporation制造] (B-6)月桂基葡糖苷[MYDOL 12，Kao Corporation制造] (B-7)单辛酸癸基甘油酯[SY-GLYSTER MCA750，SAKAMOTOYAKUHIN KOGYO CO.，LTD.制造] (B-8)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOL SP-L10，KaoCorporation制造] (B-9)聚氧乙烯(6)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L106，Kao Corporation制造] (B-10)聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯[RHEODOLTW-L120，Kao Corporation制造] 以重量计将活性成分混合，使得组分(C)或组分(C′)的浓度固定在1wt％，而组分(B)的浓度选自1wt％、3wt％、6wt％和10wt％，余量为离子交换水。混料使用Mueller-Hinton肉汤[Nippon BectonDickinson Co.，Ltd.制造]稀释至组分(C)或组分(C′)的浓度为100ppm。取2mL稀释液，并置于24-孔微量培养板[ASAHI TECHNO GLASSCORPORATION制造]中。
假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)、沙雷氏菌(粘质沙雷氏菌NBRC 12648)和克雷白杆菌(肺炎克雷白杆菌ATCC 13883)各自使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时，以形成集落。使用无菌竹签从形成的集落中取非常少量的细菌集落接种在微量培养板上的每种上述检测溶液中。将接种溶液在37℃下孵育48小时，然后弃去培养溶液，通过肉眼评价观察粘附在微量培养板上的生物膜形成的状态。将生物膜形成的状态分级，使得其中生物膜覆盖培养板壁表面的0-小于20％的状态定为A级，其中生物膜覆盖壁表面的20％或更多-小于40％的状态定为B级，其中生物膜覆盖壁表面的40％或更多-小于60％的状态定为C级，其中生物膜覆盖壁表面的60％或更多的状态定为D级。
结果显示在表9-1至表9-2中。
实施例10减少大容量塑料杯中生物膜生成的实验 假单胞菌(绿脓假单胞菌NBRC 13275)使用大豆-酪蛋白消化琼脂[SCD琼脂培养基；Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造]在37℃下预培养24小时。将在培养基中生长的集落刮除，并悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，然后将混悬液通过以5,000xg在10℃下离心15分钟离心两次进行洗涤。得到的沉淀物再次悬浮在10mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，以制备细菌混悬液，该混悬液中的细菌浓度调节至600nm处的吸光度为1.0(OD600＝1.0)。此后，将100mLMueller-Hinton肉汤[Nippon Becton Dickinson，Co.，Ltd.制造]和选自实施例9的15种检测药物的每种均置于200-mL无菌旋盖杯[EIKENKIZAI CO.，LTD.制造]中，并充分混合。组分(C)或组分(C′)的浓度调节至5ppm、10ppm、50ppm、100ppm或500ppm，然后将0.1mL如上所述制备的细菌混悬液接种至其中。而且，同时提供作为对照的检测部分，在对照中细菌如上所述接种在没有添加药物的Mueller-Hinton肉汤中。
将这些样品在37℃下静置培养，并在开始培养后的指定时间点1天、2天、3天和5天时，测量培养溶液中细菌细胞的数量，并通过肉眼评价观察杯内形成的生物膜。随后，将培养溶液在5℃下以10,000xg离心30分钟，去掉沉淀，在真空干燥器中干燥24小时，称重，由此测量的重量作为培养溶液中产生的生物膜的重量。而且，对生物膜形成的状态进行分级，使得其中确认杯中没有生物膜的状态定为A级；其中杯内在气-液界面处开始形成生物膜的状态定为B级，其中生物膜的形成从气-液界面向下扩散至培养溶液的状态定为C级。
结果显示在表10-1-1至表10-2-5中。
从上述结果发现，含有式(4)所代表的化合物的实施例产品可以有效地长期抑制生物膜的形成。
权利要求
1.一种生物膜形成抑制剂组合物，其包括下列组分(A)
(A)选自式(1)和式(2)所代表的化合物的至少一种或多种化合物或其盐
R1O-(EO)p-H(1)
其中R1和R2可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；EO代表乙烯氧基基团；p代表0至5的整数；且m和n各自是平均累计摩尔数，m+n是0-30的数；和
(B)表面活性剂，
其中组分(A)和组分(B)的重量比(A)/(B)不大于2。
2.根据权利要求1所述的生物膜形成抑制剂组合物，其中所述组分(B)表面活性剂是选自阴离子表面活性剂和除组分(A)之外的非离子表面活性剂的至少一种或多种表面活性剂。
3.一种抑制生物膜形成的方法，其通过使微生物接触如权利要求1或2所述的生物膜形成抑制剂组合物来抑制生物膜形成。
4.根据权利要求3所述的抑制生物膜形成的方法，其中所述生物膜形成抑制剂组合物和所述微生物之间的所述接触连续进行。
5.根据权利要求3或4所述的抑制生物膜形成的方法，其中所述生物膜形成抑制剂组合物在使用时的所述组分(A)的浓度按重量计为1至10,000ppm。
6.一种组合物作为生物膜形成抑制剂组合物的用途，所述组合物包括下列组分(A)
(A)选自式(1)和式(2)所代表的化合物的至少一种或多种化合物或其盐
R1O-(EO)p-H (1)
其中R1和R2可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；EO代表乙烯氧基基团；p代表0至5的整数；且m和n各自是平均累计摩尔数，m+n是0-30的数；和
(B)表面活性剂，
其中组分(A)和组分(B)的重量比(A)/(B)不大于2。
7.一种生物膜形成抑制剂组合物，其包括下列组分(C)
(C)选自式(3)和式(4)所代表的化合物的至少一种或多种化合物
R3—SH
(3)
其中R3和R4可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；且R5代表氢原子，或具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。
8.根据权利要求7所述的生物膜形成抑制剂组合物，其进一步包括作为组分(B)的表面活性剂。
9.根据权利要求8所述的生物膜形成抑制剂组合物，其中组分(B)表面活性剂是选自阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的至少一种或多种表面活性剂。
10.一种抑制生物膜形成的方法，其通过使生物膜接触如权利要求7-9中任意一项所述的生物膜形成抑制剂组合物来抑制生物膜形成。
11.根据权利要求10所述的抑制生物膜形成的方法，其中所述生物膜形成抑制剂组合物和所述微生物之间的所述接触连续进行。
12.根据权利要求10或11所述的抑制生物膜形成的方法，其中所述生物膜形成抑制剂组合物在使用时的所述组分(C)的浓度按重量计为1至10,000ppm。
13.一种下列组分(C)作为生物膜形成抑制剂的用途
(C)选自式(3)和式(4)所代表的化合物的至少一种或多种化合物
R3—SH
(3)
其中R3和R4可以相同或不同，各自代表烷基或烯基，所述烷基或烯基是具有8-14个碳原子的直链或支链；且R5代表氢原子，或具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。
全文摘要
本发明提供一种用于抑制生物膜形成的药物和组合物。本发明的生物膜形成抑制剂组合物含有下列组分(A)(A)选自式(1)至式(4)所代表的至少一种或多种化合物或其盐其中R1至R5各自代表烷基或类似基团；EO代表乙烯氧基基团；p代表从0至5的整数；且m+n代表从0至30的数；和(B)表面活性剂。
文档编号A01N31/00GK101437393SQ200780015429
公开日2009年5月20日 申请日期2007年3月23日 优先权日2006年3月23日
发明者冈野哲也, 岩崎慎也, 矶部和雄, 石塚英子 申请人:花王株式会社