专利名称：银莲花的组织培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的组织培养方法，尤其是涉及银莲花的组织培养方法。
背景技术：
银莲花为毛茛科、银莲花属植物，广布于世界各地，最常见于北温带的林地和草 甸，是多年生草本。银莲花基生叶4-8片，叶柄长6-30cm，疏生长柔毛。叶片呈圆肾形，3全 裂，花2-5朵，直径3. 5-5cm，粉红色。银莲花的花期为秋季，瘦果上有长绵毛。因花色鲜艳， 银莲花广泛栽培在花园中，是受欢迎的秋季开花的沿边花坛花卉，但是，作为国外引进的新 品种，银莲花的引种数量较少，种苗供应受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可提高繁殖速 度和苗的整齐度，并提高性状稳定性的银莲花的组织培养方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现银莲花的组织培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)无菌材料的获得取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗l_3h后于超净工作 台上，依次利用质量浓度为70-75%的乙醇浸泡10-50s，体积浓度为0. 5_2%。的汞浸泡 10-30min，再用无菌水冲洗4_6次，利用无菌滤纸吸干表面的水分后，再切成0. 5-2cm长的 带腋芽的节段，节段接种于芽诱导培养基上；(2)芽的分化和增殖节段接种于芽诱导培养基上2-4周后，腋芽部位开始膨大，出现黄绿色突起，3-5 周后可见芽分生组织，再培养1-2个月，不定芽可以长到2-3cm，将不定芽切下转入芽的增 殖培养基中进行增殖培养，不定芽基部的愈伤组织较多，但不影响增殖，不定芽生长迅速且 无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；(3)不定芽壮苗培养在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有2-3株能够伸长，其余的处于矮 化状态，将丛生芽分成小丛后，转至壮苗培养基上生长，不定芽迅速伸长；(4)生根培养取3_4cm的不定芽小植株，转接入生根培养基中诱导生根，5-15天后幼苗基部分 化出白色的根原基，25-40天后可以长至4-6cm，根系粗壮，须根众多，生根率为90-100% ；(5)炼苗与移栽生根培养15-30天，根系长至0. 5-lcm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室 内开瓶炼苗2-4天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化20-40天，即 可移栽室外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为90-95%。所述的芽诱导培养基包括MS+6-BA1. 0-5. 0mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L。
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所述的芽诱导培养基优选MS+6-BA3. 0mg/L+NAA0. 3mg/L。所述的芽的增殖培养基包括MS+6-BA0. 5-2. Omg/L+NAAO. 1-0. 2mg/L。所述的芽的增殖培养基优选MS+6-BA2. Omg/L+NAAO. 2mg/L。所述的壮苗培养基包括MS+6-BA0. 5-2. Omg/L+NAAO. 1-0. 2mg/L。
所述的壮苗培养基优选 MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L。所述的生根培养基包括MS+NAA0. 05-0. 2mg/L。所述的生根培养基优选MS+NAAO. 05mg/L。所述的培养基还包括蔗糖20_40g/L、琼脂粉4_8g/L，培养基pH5. 5-6. 0，培养温度 24-26°C，光照 1500-25001x。与现有技术相比，本发明通过组培技术，极大提高了银莲花的繁殖速度和苗的整 齐度，并提高了其性状的稳定性，可实现育苗的工厂化大批量生产。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1(1)无菌材料的获得取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗Ih后于超净工作台 上，依次利用质量浓度为70%的乙醇浸泡10s，体积浓度为0. 5%。的汞浸泡lOmin，再用无菌 水冲洗4次，利用无菌滤纸吸干表面的水分后，再切成0. 5cm长的带腋芽的节段，节段接种 于包括MS+6-BA1. Omg/L+NAAO. lmg/L的芽诱导培养基上；(2)芽的分化和增殖节段接种于芽诱导培养基上2周后，腋芽部位开始膨大，出现黄绿色突起， 3周后可见芽分生组织，再培养1个月，不定芽可以长到2cm，将不定芽切下转入包括 MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L的芽的增殖培养基中进行增殖培养，不定芽基部的愈伤组织 较多，但不影响增殖，不定芽生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；(3)不定芽壮苗培养在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有2株能够伸长，其余的处于矮化 状态，将丛生芽分成小丛后，转至包括MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L的壮苗培养基上生长， 不定芽迅速伸长；(4)生根培养取3cm的不定芽小植株，转接入包括MS+NAAO. 05mg/L的生根培养基中诱导生根， 5天后幼苗基部分化出白色的根原基，25天后可以长至4cm，根系粗壮，须根众多，生根率为 90% ；(5)炼苗与移栽生根培养15天，根系长至0. 5cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开 瓶炼苗2天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化20天，即可移栽室 外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为90%。上述各种情况的培养基还包括蔗糖20g/L、琼脂粉4g/L，pH= 5. 5，培养温度24°C， 光照 15001x。
实施例2(1)无菌材料的获得取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗2h后于超净工作台 上，依次利用质量浓度为75%的乙醇浸泡30s，体积浓度为1%。的汞浸泡15min，再用无菌水 冲洗5次，利用无菌滤纸吸干表面的水分后，再切成Icm长的带腋芽的节段，节段接种于包 括MS+6-BA3. 0mg/L+NAA0. 3mg/L的芽诱导培养基上；(2)芽的分化和增殖节段接种于芽诱导培养基上3周后，腋芽部位开始膨大，出现黄绿色突起， 4周后可见芽分生组织，再培养1个半月，不定芽可以长到3cm，将不定芽切下转入包括 MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 2mg/L的芽的增殖培养基中进行增殖培养，不定芽基部的愈伤组织 较多，但不影响增殖，不定芽生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；(3)不定芽壮苗培养在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有3株能够伸长，其余的处于矮化 状态，将丛生芽分成小丛后，转至包括MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 2mg/L的壮苗培养基上生长， 不定芽迅速伸长；(4)生根培养取4cm的不定芽小植株，转接入包括MS+NAA0. 05mg/L的生根培养基中诱导生根， 10天后幼苗基部分化出白色的根原基，30天后可以长至6cm，根系粗壮，须根众多，生根率 为 100% ；(5)炼苗与移栽生根培养20天，根系长至Icm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶 炼苗3天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化30天，即可移栽室外， 给予肥水管理，最终的移栽成活率为100%。上述各种情况的培养基还包括蔗糖30g/L、琼脂粉6g/L，pH = 5. 8，培养温度25°C， 光照 20001x。实施例3(1)无菌材料的获得取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗3h后于超净工作台 上，依次利用质量浓度为75%的乙醇浸泡50s，体积浓度为2%。的汞浸泡30min，再用无菌水 冲洗6次，利用无菌滤纸吸干表面的水分后，再切成2cm长的带腋芽的节段，节段接种于包 括MS+6-BA5. 0mg/L+NAA0. 5mg/L的芽诱导培养基上；(2)芽的分化和增殖节段接种于芽诱导培养基上4周后，腋芽部位开始膨大，出现黄绿色突起， 5周后可见芽分生组织，再培养2个月，不定芽可以长到2cm，将不定芽切下转入包括 MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 2mg/L的芽的增殖培养基中进行增殖培养，不定芽基部的愈伤组织 较多，但不影响增殖，不定芽生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；(3)不定芽壮苗培养在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有3株能够伸长，其余的处于矮化 状态，将丛生芽分成小丛后，转至包括MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 2mg/L的壮苗培养基上生长，
5不定芽迅速伸长；(4)生根培养取3cm的不定芽小植株，转接入包括MS+NAAO. 2mg/L的生根培养基中诱导生根，15 天后幼苗基部分化出白色的根原基，40天后可以长至5cm，根系粗壮，须根众多，生根率为 96% ；(5)炼苗与移栽生根培养30天，根系长至Icm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶 炼苗4天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化40天，即可移栽室外， 给予肥水管理，最终的移栽成活率为96%。上述各种情况的培养基还包括蔗糖40g/L、琼脂粉8g/L，pH = 6. 0，培养温度26°C， 光照 25001x。
权利要求
银莲花的组织培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)无菌材料的获得取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗1-3h后于超净工作台上，依次利用质量浓度为70-75％的乙醇浸泡10-50s，体积浓度为0.5-2‰的汞浸泡10-30min，再用无菌水冲洗4-6次，利用无菌滤纸吸干表面的水分后，再切成0.5-2cm长的带腋芽的节段，节段接种于芽诱导培养基上；(2)芽的分化和增殖节段接种于芽诱导培养基上2-4周后，腋芽部位开始膨大，出现黄绿色突起，3-5周后可见芽分生组织，再培养1-2个月，不定芽可以长到2-3cm，将不定芽切下转入芽的增殖培养基中进行增殖培养，不定芽基部的愈伤组织较多，但不影响增殖，不定芽生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；(3)不定芽壮苗培养在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有2-3株能够伸长，其余的处于矮化状态，将丛生芽分成小丛后，转至壮苗培养基上生长，不定芽迅速伸长；(4)生根培养取3-4cm的不定芽小植株，转接入生根培养基中诱导生根，5-15天后幼苗基部分化出白色的根原基，25-40天后可以长至4-6cm，根系粗壮，须根众多，生根率为90-100％；(5)炼苗与移栽生根培养15-30天，根系长至0.5-1cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶炼苗2-4天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化20-40天，即可移栽室外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为90-95％。
2.根据权利要求1所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的芽诱导培养基 包括 MS+6-BA1. 0-5. 0mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L。1
3.根据权利要求2所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的芽诱导培养基 优选 MS+6-BA3. 0mg/L+NAA0. 3mg/L。
4.根据权利要求1所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的芽的增殖培养 基包括 MS+6-BA0. 5-2. 0mg/L+NAA0. 1-0. 2mg/L。
5.根据权利要求4所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的芽的增殖培养 基优选 MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 2mg/L。
6.根据权利要求1所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的壮苗培养基包 括 MS+6-BA0. 5-2. 0mg/L+NAA0. 1-0. 2mg/L。
7.根据权利要求6所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的壮苗培养基优 选 MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L。
8.根据权利要求1所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的生根培养基包 括 MS+NAA0. 05-0. 2mg/L。
9.根据权利要求8所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的生根培养基优 选 MS+NAA0. 05mg/L。
10.根据权利要求2或4或6或8所述的银莲花的组织培养方法，其特征在于，所述的培养 基还包括蔗糖20-40g/L、琼脂粉4-8g/L，培养基pH5. 5-6. 0，培譜显度24-26V，光照1500-25001x。
全文摘要
本发明涉及银莲花的组织培养方法，包括无菌材料的获得，芽的分化和增殖，不定芽壮苗培养，生根培养，炼苗与移栽等步骤。与现有技术相比，本发明大大提高了银莲花的繁殖速度和苗的整齐度，并提高了其性状的稳定性，可实现育苗的工厂化大批量生产。
文档编号A01H4/00GK101869067SQ20091004997
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月24日 优先权日2009年4月24日
发明者沈勤, 陈建华, 黄建荣 申请人:上海上房园林植物研究所