专利名称：节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法
技术领域：
本发明涉及节旋藻研究与开发应用的技术，特别涉及节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法。
背景技术：
节旋藻UriAro1^ira)是一种光合放氧、呈规则螺旋形的原核丝状微藻，系蓝藻门 (Cyanophyta)、亶员藻目(Oscillatoriales)、亶员藻禾斗(Oscillatoriaceae)的一个属，通常又称为螺旋藻(分[胡鸿钧.武汉植物学研究，1997，15(4) 369-374]。因其富含优质蛋白和多种生物活性物质而受到国内外的极大关注，目前已在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，并广泛应用于食品、生物医药保健、饲料、精细化工等领域。该属中的钝顶节旋藻Urthrospim phte/^is)是国内外商业化养殖生产与开发应用最广泛的品种。我国是全球生产与出口螺旋藻粉的主要国家，产量近占世界总产量的一半[Wang，et al. Journal of Phycology. 2005, 41: 622—628]。手性(chirality or handedness)系指左右对称性的差异特征。手性在自然界普遍存在，如一些植物的藤蔓等往往呈螺旋状，根据其螺旋取向可区分为左手性或左旋 (Left-handed)、右手性或右旋(Right-handed)，以及无手性特征的手中性(No_chiral )。 手性取向可按业内通用的左右手定则进行判别。节旋藻藻丝在分类学上典型的形态学特征为由多个柱状细胞串联成丝状、不分枝、有规则、疏松或紧密的螺旋形，但在某些条件下会发生多形性变异甚至完全变直(手中性)[Wang，et al. Journal of Phycology. 2005， 41: 622-628]。节旋藻藻丝螺旋的本征取向为左手性，很难使其变成右手螺旋并获得纯培养物。节旋藻相对于拟南芥和蜗牛等其它生物而言，具有螺旋手性典型、遗传背景简单、生长周期短等优点，因而是用于研究生物手性形成与调控的理想材料。为此，迫切需要建立将螺旋本征取向为左手性的节旋藻藻丝构建成右手性藻丝，以及使右手螺旋藻丝能稳定生长繁殖获得其纯培养物的方法，以满足当前节旋藻研究及开发利用的实际需要。
发明内容
本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，目的是提供一种节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法。为解决技术问题，本发明的方案是
提供节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法，包括以下步骤
(1)取3 ml 在AB培养液[Rippka, et al. Journal of General Microbiology, 1979， 111 1-61]中继代培养至少1年、螺旋手性本征取向为左手的钝顶节旋藻藻液于5 ml离心管中，在高速台式离心机上以8000 12000 rpm的转速离心1(T15 min，弃去上清，沉淀加入 3 ml Zarrouk 培养液[Zarrouk, Ph. Dr. These, Univ. Paris, France, 1966]并摇勻， 如此重复3次，以使Zarrouk培养液充分替代AB培养液；
(2)置于光照强度为40 68Mffl0Pnr2M-1,光照时温度为25 35°C、黑暗时温度为25°C，光照12 h/黑暗12 h条件下培养；
(3)每隔2d取样在显微镜上观察藻丝螺旋取向，直至发现右手螺旋手性藻丝；
(4)挑出右手螺旋手性藻丝，并接入Zarrouk培养液，置于光照强度为 40 68|^01·!!!-2·^，光照时温度为25 35°C、黑暗时温度为25°C，光照12 h/黑暗12 h条件下培养，约20 d后获得右手性螺旋手性藻丝的纯培养物。作为一种改进，所述在高速台式离心机上的离心速率为11000 rpm，离心时间为10
min。作为一种改进，所述培养时的光照强度为54 μπιοΡπΓ2·^，光照时温度为30°C。本发明的有益效果在于
本发明所通过更换培养液及限定培养光照强度和温度的方法，可使螺旋本征手性为左手的节旋藻藻丝逆转为右手螺旋藻丝，并获得其纯培养物。这种方法具有操作简便、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、应用性强等优点。
图1为左旋的钝顶节旋藻品系ZJU0137 ；
图2为利用本发明的方法将ZJU0137逆转成为右手螺旋藻丝； 图3为左旋的钝顶节旋藻品系ZJU0145 ； 图4为利用本发明的方法将ZJU0145逆转成为右手螺旋藻丝。
具体实施例方式本发明的技术方案可以通过以下步骤实现。实例1
选用样本材料；为公知的钝顶节旋藻品系ZJU0137，其藻丝的螺旋本征手性为左手，这株节旋藻品是实验室常用的品系，在发明人所在的浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存，可随时提供样本。试剂和仪器本发明中所用的培养液成分均为国产分析纯。光学显微镜为日本 OLYMPUS生产，型号为CH-30。构建节旋藻右手螺旋藻丝及其纯培养的方法的主要步骤如下
(1)取3 ml 在AB培养液[Rippka, et al. Journal of General Microbiology, 1979， 111 1-61]中继代培养至少1年、螺旋手性本征取向为左手的钝顶节旋藻藻液于5 ml离心管中，在高速台式离心机上以8000 12000 rpm的转速离心1(T15 min，弃去上清，沉淀加入 3 ml Zarrouk 培养液[Zarrouk, Ph. Dr. These, Univ. Paris, France, 1966]并摇勻， 如此重复3次，以使Zarrouk培养液充分替代AB培养液；
(2)置于光照强度为40 68Mfflol^nT2M-1,光照时温度为25 35°C、黑暗时温度为25°C， 光照12 h/黑暗12 h条件下培养；
(3)每隔2d取样在显微镜上观察藻丝螺旋取向，直至发现右手螺旋手性藻丝；
(4)挑出右手螺旋手性藻丝，并接入Zarrouk培养液，置于光照强度为 40 68|^01·!!!-2·^，光照时温度为25 35°C、黑暗时温度为25°C，光照12 h/黑暗12 h条件下培养，约20 d后获得右手性螺旋手性藻丝的纯培养物。
实例2 选取公知、藻丝螺旋本征手性为左手的顿顶节旋藻品系ZJU0145为样本， 利用本发明的方法也构建出其右手螺旋藻丝，并获得其纯培养。
权利要求
1.节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法，包括以下步骤(1)取3ml在AB培养液中继代培养至少1年、螺旋手性本征取向为左手的钝顶节旋藻藻液于5 ml离心管中，在高速台式离心机上以8000 12000 rpm的转速离心10 15 min，弃去上清，沉淀加入3 ml Zarrouk培养液并摇勻，如此重复3次，以使Zarrouk培养液充分替代AB培养液；(2)置于光照强度为40 68Mffl0Pnr2M-1,光照时温度为25 35°C、黑暗时温度为25°C， 光照12 h/黑暗12 h条件下培养；(3)每隔2d取样在显微镜上观察藻丝螺旋取向，直至发现右手螺旋手性藻丝；(4)挑出右手螺旋手性藻丝，并接入Zarrouk培养液，置于光照强度为4(Γ68 μπιοΡπΓ2·^，光照时温度为25 35°C、黑暗时温度为25°C，光照12 h/黑暗12 h条件下培养，20 d后获得右手性螺旋手性藻丝的纯培养物。
2.根据权利要求1所述节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法，其特征在于，所述在高速台式离心机上的离心速率为11000 rpm，离心时间为10 min。
3.根据权利要求1所述节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法，其特征在于，所述培养时的光照强度为54 μπιοΡπΓ2·^，光照时温度为30°C。
全文摘要
本发明涉及节旋藻研究与开发应用的技术，旨在提供一种节旋藻右手螺旋藻丝的构建及纯培养方法。包括步骤(1)取在AB培养液中继代培养至少1年、螺旋手性本征取向为左手的钝顶节旋藻藻液，高速离心，弃去上清，沉淀加入Zarrouk培养液并摇匀，重复以充分替代AB培养液；(2)置于光照强度为40~68μmol m-2 s-1，光照时温度为25~35℃、黑暗时温度为25℃，光照12h/黑暗12h条件下培养；(3)每隔2d取样观察；(4)挑出右手螺旋手性藻丝，并接入Zarrouk培养液，按前述方式培养20d后获得纯培养物。本发明的方法具有操作简便、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、应用性强等优点。
文档编号A01G33/00GK102177840SQ20111007702
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者刘新颖, 孙霖润, 汪志平, 王景梅, 董丹丹, 蓝瑾瑾, 谢彦广, 邵斌 申请人:浙江大学