专利名称：可诱导性组织特异性表达载体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及可诱导性组织特异性表达载体及其用途。具体涉及microRNA可诱导性组织特异性表达载体及用途，尤其是一种Cre酶介导的、可诱导的、组织特异的miRNA表达载体pEFG LPAL-MIR，所述载体可用表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型。
背景技术：
研究报道，microRNA是由21_25个核苷酸组成的小的内源性非编码的单链RNA分子，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生；所述前体在细胞之中被RNaseIII Dicer切割成约22个核苷酸的microRNA双链，其中一条链被降解，另外一条被加工成成熟的microRNA。在动物细胞实验中，microRNA—般通过部分序列同源性于靶基因mRNA的3’ -UTR (3’端非编码区)结合，导致翻译阻止，在很少的情况下，导致mRNA的降解。microRNA的发现揭示了一种新的基因调节机制，在发育和细胞分化 方面起具有重要的作用和意义。研究揭示，miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，如，早期发育，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡，脂肪代谢以及细胞分化等。有研究发现microRNA与许多疾病的发生有很大的关系，比如肿瘤，心脏病等等，可进一步指导疾病的诊断。由于microRNA存在的广泛性和多样性，并且很多miRNA的表达具有组织以及发育阶段表达的特异性，因此提示microRNA可能有更加广泛多样的生物功能。目前有关疾病的研究需要可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型，但迄今为止，尚未见有专门用于构建转基因试验动物模型尤其是转基因试验小鼠的miRNA表达载体，加之普通的CMV启动子很容易在ES细胞中被沉默，这些都为microRNA的研究或者转基因试验动物模型的制备造成了很大的困难。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可诱导性组织特异性表达载体，具体涉及可诱导的、组织特异的miRNA表达载体，尤其是一种Cre酶介导的、可诱导的、组织特异的miRNA表达载体pEFG LPAL-MIR。所述载体可用于表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型。本发明的进一步目的是提供所述的表达载体在用于表达microRNA,和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型中的用途。本发明以内含子方式表达miRNA，所述的载体在不影响标记基因EGFP表达的同时，还能实现miRNA的有效表达；该载体可用于体外实验以及转基因小鼠，所述的Cre酶对该载体的表达具有很好的可诱导性。本发明的表达载体中，在pEGFP质粒的基础上，加入了 EFl alpha启动子。具体而言，本发明的可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，主要包括以下结构EF1 a启动子，EGFP荧光标记基因，两端连有同向LoxP序列的BGH polyA加尾转录终止序列和内部引入酶切位点的内含子序列；所述的载体为pEFG LPAL-MIR，具有序列I的结构。本发明中，所述载体使用EFl alpha通用启动子驱动基因表达；EGFP荧光标记基因用于指示基因的表达；然后是两段连有同向LoxP71和LoxP66的BDH polyA加尾转录终止信号，可以被Cre酶诱导；在所述的终止信号其后的是一段内含子序列，表达miRNA前体插入该内含子中；
本发明中，EFl a启动子具有较高水平表达且不容易被沉默；
本发明中，EGFP荧光标记基因便于将来转基因小鼠的鉴定及实时观测转基因的表
达； 本发明中，Cre酶可有效介导该两端连有同向LoxP序列的BGH polyA加尾转录终止序列的切除，从而有效控制3’序列的转录与否；
本发明中，对内含子序列进行了改造，引入酶切位点，从而可将miRNA前体插入该位点，实现miRNA前体的有效剪切，并不干扰其前面的EGFP荧光基因表达。本发明的实施例中，采用EFla，实现miR424基因座位的高表达，并且为了防止在将来转基因动物中所转的基因被沉默；引入了 EGFP荧光标记蛋白，便于鉴定转基因小鼠以及实时监控转基因的表达；c)在miRNA前体的两端分别加入了内含子供体和受体序列(可将miRNA前体从转录本中作为内含子切除，并加工形成成熟体)，使miRNA的串联表达不影响EGFP的表达；在EGFP基因和miR424前体之间插入了一段PolyA加尾转录终止信号，并在加尾信号两端各加入一段LoxP序列，通过与心肌特异表达Cre的小鼠杂交，可将该PolyA加尾转录终止信号在心肌细胞中特异环化切除，实现在Fl代小鼠心肌中特异上调特定miRNA的表达，实现miRNA组织特异的表达上调，并防止过表达导致第一代转基因小鼠死亡。本发明的microRNA可诱导性组织特异性表达载体,经体外实验表明，Cre对该miRNA表达载体具有很好的可诱导性。本发明中，在EGFP后加入了两个同向的LoxP71和LoxP66位点，这两个LoxP都具有突变的位点，保证在与ere重组后残留的LoxP与染色体上其他的LoxP发生重组。在这两个LoxP位点中间加入了 BDH的polyA序列，使得在未与ere酶重组之前microRNA不能表达，避免了在转基因小鼠制备中出现Fl代因为miCToRNA过表达而可能导致的胚胎死亡。本发明载体具有以下特点
1)可解决某些致死性miRNA转基因动物建立的困难某些miRNA的表达上调具有严重的病症，例如miR-1过表达的引起心律异常，所以这些miRNA的表达上调对于动物来说可能是致死性的，所以这类miRNA不容易获得高表达转基因小鼠，而该载体转基因小鼠在未与Cre小鼠杂交前，是不表达miRNA的，所以解决了致死性miRNA转基因小鼠的建立难题；
2)可方便的实现特定miRNA的组织性特异表达以及发育阶段性表达常规建立组织特异性表达转基因小鼠的建立是通过使用组织特异性启动子，这一方式有其局限性，即一旦转基因动物建立，将不能较为机动的实现其他组织的表达。而该载体建立转基因小鼠，可通过选择组织特异性以及发育阶段特异性Cre小鼠，机动的在不同组织及不同阶段上调目的miRNA。3) EFl a启动子选用以及内含子表达miRNA的方式，也是实现miRNA有效表达的保证，并保证miRNA的表达不会干扰串联标记的表达；
4)与miRNA串联的EGFP基因可简化转基因动物筛选及实时监测。本发明将获得的载体转染HEK293细胞通过荧光观察和RT-PCR方法确定了microRNA的表达。本发明对构建的表达载体转染小鼠E14细 胞，通过荧光观察和RT-PCR方法确定了microRNA在小鼠ES细胞的表达。本发明用获得的表达载体制备转基因小鼠，在Fl代中有存活的带有绿色荧光的小鼠。本发明中构建的microRNA表达载体可以成功的表达特异的microRNA,并且可以通过多种方法确定microRNA的表达。本发明中的表达载体在ES细胞中，microRNA表达不容易被沉默，能成功的应用于转基因小鼠的制备。
图 I表明将pEFG LPAL-mir-363,pEFG LPAL-mir-363 ere后，pEFG LPAL-mir-424,pEFG LPAL-mir-424 ere后质粒转染小鼠干细胞E14中(使用转染试剂LTX)，24h后通过观察绿色荧光鉴别质粒表达。图2表明本发明中细胞转染48h后抽提细胞RNA，经加尾法RT-PCR后检测miR-363和miR-424的表达，18s做内参，ere后miRNA可表达。图3表明本发明中特定的内含子引物loxp71 BGH F/loxp66 BGH T PCR显示miRNA剪切加工后内含子变小。
具体实施例方式实施例I 构建 pEFG LPAL-MIR I)插入EFl alpha启动子
根据PEBG质粒序列设计带有相应酶切位点的引物，将EFl alpha启动子序列经过PCR-酶切-连接反应构建到pEGFP-cl质粒中，经测序比对EFl alpha启动子序列无突变，并将此构建好的质粒命名为PEFG。2)插入 LoxP-polyA-LoxP 序列
化学合成各 35bp 的 LoxP71 和 LoxP66。polyAl 序列来自于 pcDNA3. I (+)中 BGH polyA序列。将3段序列用重叠PCR的方法串联，顺序为L0XP71-p0lyAl-L0XP66，并且两个LoxP位点保持顺位方向，将此段DNA经过酶切-连接反应构建到pEFG载体中，经测序比对无突变,命名为pEFG LPAL。3)插入 intron 序列
内含子(intron)序列来自于pRL-renilla质粒，将intron D和intron R通过重叠PCR方法中间依次引入Bgl II，EcoR V，Sall I酶切位点，并将获得的DNA插入到pEFGFP质粒SV40 polyA序列前，构建好的质粒命名为pEFG LPAL-MIR，全长为6287bp (具有如序列I的结构)。实施例2 pEFG LPAL-MIR 的应用
I)构建 pEFG LPAL-mir-363 和 pEFG LPAL-mir-424将mir-363和mir-424前体序列通过PCR反应获得，并插入到pEFG LPAL-MIR载体中，
经测序无突变。2)质粒体外与ere酶(NEB)重组 反应体系(20ul)
质粒5-10ng
IOXBuffer2ul
Cre0. 5ul
ddH20to 20ul
37° C 30min,72° C IOmin0转化T0P10 感受态，37° C 12h，克隆 PCR 鉴定(引物为 loxp71 BGH F/loxp66 BGHT )，无明显条带的为已经环化切除的质粒，并经测序确认。3)pEFG LPAL-MIR在小鼠胚胎干细胞中的表达
如图 I 所示，将pEFG LPAL-mir-363,pEFG LPAL-mir-363 ere 后，pEFG LPAL-mir-424,pEFG LPAL-mir-424 ere后质粒转染小鼠干细胞E14中(使用转染试剂LTX)，24h后通过观察绿色荧光鉴别质粒表达。如图2所示，细胞转染48h后抽提细胞RNA，经加尾法RT-PCR后检测miR-363和miR-424的表达，18s做内参，ere后miRNA可表达。如图3所示，特定的内含子引物loxp71 BGH F/loxp66 BGH T PCR显示miRNA剪切加工后内含子变小。实施例3制备转基因小鼠
将pEFG LPAL-mir-363和pEFG LPAL-mir-424质粒线性化后(ApaL I)按常规方法转入小鼠的受精卵，将该受精卵植入雌性小鼠体内，结果显示，Fl代小鼠经绿色荧光蛋白表达鉴定为转基因小鼠。
权利要求
1.可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，主要包括以下结构=EFla启动子，EGFP荧光标记基因，BGH polyA加尾转录终止序列和内含子序列；所述的载体为pEFGLPAL-MIR，具有序列I的结构。
2.按权利要求I所述的可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，所述的BGHpolyA加尾转录终止序列为两端连有同向LoxP序列的转录终止序列。
3.按权利要求I所述的可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，所述的内含子序列其内部引入酶切位点。
4.权利要求I的可诱导性组织特异性表达载体的构建方法，其特征在于，其包括步骤 1)插入EFlalpha启动子 将EFl alpha启动子序列插入到pEGFP_cl质粒中，得质粒pEFG ； 2)插入LoxP-poIyA-LoxP 序列 将LoxP71和LoxP66和BGH polyA序列用重叠PCR的方法串联，得顺序为LoxP71-polyAl-LoxP66的DNA段，将其插入到pEFG载体中，得质粒pEFG LPAL ； 3)插入intron序列 内含子序列intron D和intron R通过重叠PCR方法中间依次引入Bgl II, EcoR V,Sall I酶切位点，并将获得的DNA插入pEFG LPAL质粒SV40 polyA序列前，构建得pEFGLPAL-MIR，全长为6287bp，具有如序列I的结构。
5.按权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤2的LoxP71和LoxP66为化学合成；所述的两个LoxP位点为顺位方向。
6.权利要求I的可诱导性组织特异性表达载体在提高miRNA的有效表达中的用途。
7.按权利要求6的用途，其特征在于所述的miRNA的有效表达是体外或体内有效表达。
8.权利要求I的可诱导性组织特异性表达载体在制备转基因试验动物模型中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及可诱导性组织特异性表达载体及其用途。本可诱导性组织特异性表达载体，主要包括以下结构EF1α启动子，EGFP荧光标记基因，两端连有同向LoxP序列的BGHpolyA加尾转录终止序列和内部引入酶切位点的内含子序列；所述载体为pEFGLPAL-MIR，其使用EF1alpha通用启动子驱动基因表达，EGFP荧光标记基因用于指示基因的表达，两段连有同向LoxP71和LoxP66的BDHpolyA加尾转录终止信号，可被Cre酶诱导；在所述的终止信号其后的是一段内含子序列，表达miRNA前体插入该内含子中。本发明中构建的microRNA表达载体可成功的表达特异的microRNA，并可通过多种方法确定microRNA的表达；所述的表达载体在ES细胞中，microRNA表达不容易被沉默，能成功的应用于转基因小鼠的制备。
文档编号A01K67/027GK102719465SQ20111007700
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者张进, 王慧君, 罗欣, 马端 申请人:复旦大学