专利名称：一种乳杆菌及其冻干菌粉与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种乳杆菌及其冻干菌粉与应用。
背景技术：
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)是普遍存在于人和动物肠道的有益乳酸杆菌，也是乳酸菌属中重要的种群之一，具有高产酸、解毒、抑菌和提高机体免疫能力等多种特性，在维持胃肠道微生态平衡、促进营养消化吸收、抑制致病菌感染及免疫调节、提高动物生长性能等方面具有重要作用。乳酸菌在动物胃肠道内必须达到一定的活菌浓度才能发挥作用，但是乳酸菌对胃酸、胆汁的抗逆性差，对温度也敏感，因此筛选抗逆性高的乳酸菌种成为乳酸菌研究的一个重要内容。另外，乳酸菌产品在常温保存时常常存在活菌数低、稳定性差等质量不稳定的问 题，如何提高活菌量并延长活菌保藏期，己成为活菌制剂产品研究开发的技术关键。利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是一种可以提高活菌有效性的好方法，冻干菌粉不仅具有活菌含量高、用量小、可直接投入生产的特点，而且能够提高产品的保存期和应用效果。真空冷冻干燥会造成部分微生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化，而适宜的冻干保护剂能够使益生菌在冻干过程中保藏最小限度死亡，减轻冷冻干燥所引起的对菌体的损伤，在保存时耐受较高的温度不损害菌体的活力。
发明内容
本发明的一个目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的乳杆菌，该乳杆菌耐酸、耐胆盐，对温度有一定的耐受性，对猪常见致病菌具有一定的抑制作用；本发明的另一个目的在于提供由该乳杆菌制备得到的冻干菌粉及其制备方法。本发明的又一个目的在于提供所述乳杆菌冻干菌粉在动物饲料添加剂中的应用。为实现本发明第一个目的提供一种乳杆菌，从健康仔猪中筛选出一株性能优良的乳酸菌菌株，将该乳杆菌菌株于2012年02月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)进行保藏，菌株名称为短乳杆菌Lactobacillus brevis ZLB004，保藏编号为CGMCCNo.5760。所述乳杆菌(Lactobacillusbrevis) ZLB004 (CGMCC No. 5760)为革兰氏阳性杆菌，菌体大小为O. 73ymX2. 13 9. 33 μ m，无芽孢。在MRS平板培养基上菌落为乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，凸起，不透明，边缘整齐。本发明提供的乳杆菌(Lactobacillus brevis) (CGMCC No. 5760)除具有上述特征之外，还具有耐酸、耐胆盐、耐高温、抑菌性好等生物学特性I)该乳杆菌在pH=2的环境中，在2小时以内存活率达到82. 35%。一般情况下，动物胃液的PH范围在2 4之间，这种酸性环境条件能够使大部分乳酸菌失活从而导致乳酸菌不能有效发挥益生作用，而本发明的乳杆菌显示出良好的耐酸性。2)该乳杆菌在O. 2%的胆盐环境中，在6小时内的存活率达到44. 17%。一般情况下，动物肠道内的胆盐浓度在O. 03% O. 3%，而肠道内容物的排空时间为2 6小时，益生菌要发挥效力必须能够耐受肠道内胆盐环境，本发明的乳杆菌显示出较好的耐受胆盐能力。3)该乳杆菌在65°C处理30秒时仍有54. 27%的存活率。乳酸菌对温度敏感，在常温保存或是制粒时容易失活影响益生效力的发挥，因此筛选具有耐较高温度的乳杆菌，可以提高乳酸菌的细胞存活率。4)该乳杆菌对常见致病菌有较强的抑制作用。大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌是猪常见的致病菌，本发明的乳杆菌对这三种致病菌具有较强的抑制作用，可以有效控制动物疾病的发生。本发明的第二个目的提供一种乳杆菌冻干菌粉，采用所述短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) ZLB004，保藏号为=CGMCC No. 5760。上述乳杆菌冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤将乳杆菌(Lactobacillusbrevis) ZLB004 (CGMCC No. 5760)进行发酵培养后得到发酵液，将所述发酵液离心分离菌体，得到菌泥，向所述菌泥加入冻干保护剂乳化冻干后，即得到所述乳杆菌冻干菌粉。所述发酵培养为二级发酵，包括如下步骤(I)以I 5%的接种量将所述乳杆菌接种于液体培养基中，在35 40°C培养20 28小时后得到种子培养物；(2)将步骤(I)得到的所述种子培养物以I 5%的接种量接种于装有30 40L液体培养基的50L发酵罐中，在温度35 37°C、转速为50 150rpm、罐压为O. 05MPa的条件下发酵20 28小时，即得到发酵液。所述的液体培养基由如下浓度的物质组成蛋白胨l(Tl4g/L、酵母浸粉5 7g/L、牛肉膏 10 14g/L、葡萄糖 20 24g/L、、K2PO4 · 3H20 2g/L、乙酸钠 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 58g/UMnSO4O. 19g/L、柠檬酸氢二铵 2g/L 和吐温 _801ml/L，pH 6. 5，121°C灭菌 15min 备用。所述的离心是在15000 20000rpm条件下以管式离心机离心发酵液，分离菌体，得到菌泥。所述的乳化冻干是指将菌泥加入与离心前体积相同的冻干保护剂，制成菌悬液，乳化均匀后冻干，即得到乳杆菌冻干菌粉。冻干条件为将乳化后的菌悬液预冻Γ3小时、冷凝温度-6(T-40°C、真空度l 10Pa、冻干时间20 28小时。所述冻干保护剂由如下质量百分比浓度的物质组成谷氨酸钠I. 5 2. 5 %、乳糖2 4%、海藻糖4 6%、脱脂乳18 22 %，其余为水。所述乳杆菌冻干菌粉在动物饲料添加剂中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的乳杆菌冻干菌粉作为添加剂应用于动物饲料，其中动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等动物，其优选猪。
本发明还提供一种冻干保护剂，由如下质量百分比浓度的物质组成谷氨酸钠
I.5 2. 5%、乳糖2 4%、海藻糖4 6%、脱脂乳18 22%，其余为水。本发明的乳杆菌(Lactobacillusbrevis)ZLB004(CGMCC No. 5760)是一株具有耐酸、耐胆盐、耐高温、抑菌性好的菌种。由该乳杆菌制成的冻干菌粉添加到生长猪饲料中，能够提高生长猪的日增重，降低料重比，增加肠道中的乳酸菌活菌含量、降低大肠杆菌含量，具有减少动物应激、促进机体健康的作用。保藏说明菌株名称短乳杆菌Lactobacillus brevis ZLB004保藏日期2012年02月16日保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101保藏编号CGMCCNo. 5760
图I为API 50CH (L)微生物鉴定系统结果。
具体实施例方式下面结合实施例详细介绍本发明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明的具体实施方式
进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。实施例I、乳杆菌的筛选鉴定剖杀健康仔猪，无菌操作刮取胃肠道黏膜上的内容物一定量于无菌生理盐水中，振荡摇匀并作十倍稀释，涂布于MRS培养基平板上，烛缸法37°C培养24 48小时。从中挑取乳白色菌落进行初步筛选，凡是革兰氏染色阳性、H2O2酶试验阴性、菌体形态为杆状的菌株可初步确定为乳杆菌，将初筛得到的菌株进行生长OD6tltol值、产酸OD45tol值、及耐酸耐胆盐试验，筛选出一株性能优良的乳酸菌菌株ZLB004，送至中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)进行鉴定，经API微生物鉴定系统鉴定和16srDNA序列分析表明，该菌鉴定为Lactobacillus brevis,其鉴定结果见图I和序列表中序列I。乳杆菌(Lactobacillusbrevis)ZLB004主要生物学特性为革兰氏染色阳性，无芽孢。菌落乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，凸起，不透明，边缘整齐。将该乳杆菌菌株于2012年02月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)进行保藏，菌株名称为短乳杆菌Lactobacillus brevis ZLB004，保藏编号为CGMCCNo.5760。MRS固体培养基配方蛋白胨lg，牛肉膏lg，酵母膏O. 5g，柠檬酸氢二胺O. 2g,葡萄糖2g, KH2PO4O. 2g，乙酸钠O. 2g，吐温-800. 1ml，硫酸镁O. 058g,硫酸锰O. 02g,琼脂2g,水 100ml, pH 6-6. 5, 115°C高压灭菌 15min。实施例2、乳杆菌抗逆性研究I、耐酸性能测定 将活化的乳杆菌以2%的接种量分别接入到pH为2和3的灭菌生理盐水中，37°C保温2小时，测定活菌数，计算存活率。试验结果见表1，乳杆菌存活率随pH的降低呈下降趋势，但在pH=2时其存活率仍高达82. 35%，显示出良好的耐酸性。表I乳杆菌耐酸性能测定
权利要求
1.一种乳杆菌，名称为短乳杆菌Lactobacillus brevis ZLB004,保藏号为CGMCCNo.5760。
2.一种乳杆菌冻干菌粉，其特征在于采用权利要求I所述的短乳杆菌LactobacillusbrevisZLB004，保藏号为=CGMCC No. 5760。
3.权利要求2所述的乳杆菌冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤将权利要求I所述的乳杆菌进行发酵培养后得到发酵液，将发酵液离心分离菌体，得到菌泥，向菌泥中加入冻干保护剂乳化冻干后，即得到所述乳杆菌冻干菌粉。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的发酵培养的方法包括如下步骤 (1)以I 5%的接种量将所述乳杆菌接种于液体培养基中，在35 40°C培养20 28小时后得到种子培养物； (2)将步骤(I)得到的所述种子培养物以I 5%的接种量接种于装有液体培养基的发酵罐中，在温度35 37°C、转速为50 150rpm、罐压为O. 05MPa的条件下发酵20 28小时，即得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的液体培养基由如下浓度的物质组成蛋白胨 l(Tl4g/L、酵母浸粉5 7g/L、牛肉膏 l(Tl4g/L、葡萄糖 2(T24g/L、K2P04*3H20 2g/L、乙酸钠 5g/L、MgS04 ·7Η20 O. 58g/L,MnSO4O. 19g/L、柠檬酸氢二铵 2g/L 和吐温 _801ml/L，pH 6. 5,121°C灭菌 15min 备用。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于所述的离心是在15000 20000rpm条件下以管式离心机离心发酵液，分离菌体，得到菌泥。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述乳化冻干是指将菌泥加入与离心前体积相同的冻干保护剂，制成菌悬液，乳化均匀后冻干，即得到乳杆菌冻干菌粉；所述冻干是在如下条件下进行将乳化后的菌悬液预冻f 3小时、冷凝温度-6(T-4(TC、真空度I 10Pa、冻干时间20 28小时； 所述冻干保护剂由如下质量百分比浓度的物质组成谷氨酸钠I. 5 2. 5%、乳糖2 4%、海藻糖4 6%、脱脂乳18 22%，其余为水。
8.权利要求2所述乳杆菌冻干菌粉在动物饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述动物指猪。
10.一种冻干保护剂，由如下质量百分比浓度的物质组成谷氨酸钠I. 5 2. 5%、乳糖2 4%、海藻糖4 6%、脱脂乳18 22%，其余为水。
全文摘要
本发明公开了一种乳杆菌及其冻干菌粉与应用，属于微生物技术领域。所述的乳杆菌名称为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZLB004，保藏号为CGMCC No.5760，是一株具有耐酸、耐胆盐、耐高温、抑菌性好的菌种。该菌进行发酵培养后进行离心，将菌泥加入冻干保护剂中冻干后得到乳杆菌菌粉。该乳杆菌菌粉作为动物饲料添加剂，能够提高生长猪的日增重，降低料重比，增加肠道中的乳酸菌活菌含量、降低大肠杆菌含量，具有减少动物应激、促进机体健康的作用。
文档编号A23K1/16GK102660477SQ201210144048
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘辉, 季海峰, 张董燕, 王四新, 王晶, 王雅民 申请人:北京市农林科学院