一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种饲用防腹泻酵母的高密度发酵及其保护冻干的活菌制剂的制备方法，属于农业生物【技术领域】。原始出发菌株布拉酵母(Saccharomyces?boulardii，ATCC?MYA-796)1株经过活化，接种到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30℃，200-250rpm，培养12-16h，作为种子液；在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，以10％的接种量接种种子液，30℃，800rpm，培养12h，然后流加25％葡萄糖6h，流加量为20ml/h/L发酵液；离心收集菌体加入保护剂(8％甘油，7.5％脱脂奶粉，7.5％海藻糖和0.9％氯化钠)，保护剂与菌体混合比例为2∶1，混匀后静置平衡1h；-80℃预冷12h，然后置于真空冷冻干燥机中冻干菌体，称取冻干菌粉进行活菌计数，其活菌计数达1.4×1010CFU/g。
【专利说明】一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法
(—)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种饲用防腹泻酵母的高密度发酵及其保护冻干的活菌制剂的制备方法，属于农业生物【技术领域】。
(二)【背景技术】
[0002]布拉酵母(Saccharomyces boulardii)是在印尼蒸枝中分离得到的的一种适温的、非毒性酵母菌，为酿酒酵母亚种。与酿酒酵母在代谢、生理和遗传特性方面又有所不同。常规微生态制剂易受抗生素、胃酸、胆汁的影响，应用受到限制，酵母生物学特性与细菌完全不同，布拉酵母是一种生理性真菌制剂，不会被胃酸、胆酸、抗生素等所破坏，因此其应用相对广泛。同时酵母对PH值变化有较好的耐受性，在pH7?8时生长良好，即使在pH值低至1.5时仍能存活，且发挥活性的最适温度为37°C，其细胞体积为细菌的10倍，使得酵母更适宜用作益生菌。使用细菌作为益生菌的最大危险是致病菌的耐药性问题，而酵母不存在类似的问题。
[0003]布拉酵母菌的防腹泻作用主要表现在:第一，预防和治疗梭菌感染和抗生素引起的肠炎；第二，预防和治疗霍乱弧菌感染；第三，布拉酵母菌能拮抗肠道病原菌、抑制毒素产生、降解毒素及毒素受体、增强肠道黏膜的免疫功能。
[0004]随着养殖业的发展，抗生素的应用越来越广泛，其对畜禽疾病的防治起了重要作用的同时又破坏了畜禽肠道菌群的微生态平衡，导致菌群失调，引起肠上皮细胞的代谢调节水平和生理功能发生紊乱,从而使畜禽体内病原菌或条件致病菌过度增殖而造成感染性腹泻。腹泻后，又会进一步加重肠道菌群的紊乱而形成恶性循环，因此，在抗感染治疗过程中。选择可有效防止肠道菌群失调又无毒副作用的生物制剂，成为畜牧业的研究热点。
[0005]布拉酵母菌作为微生态制剂的一种，具有天然、无毒副作用、安全可靠、无残留等优点，同时它属于真菌制剂，不被常用抗生素降解，可以与抗生素同时使用，口服后不会被胃酸和胆酸灭活，并在肠道内保持稳定的有效活菌浓度，预防使用抗生素带来的菌群失调。布拉酵母菌作为一种新型微生态制剂，在畜牧业中必将有广阔的应用前景。
[0006]本发明技术主要针对上述的畜禽腹泻的关键问题，通过研究布拉酵母的高密度发酵工艺、保护剂参数以及冻干工艺，最终获得一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法。为解决畜禽腹泻特别是幼龄动物的腹泻问题提供了技术支撑。
(三)
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于研究布拉酵母的高密度发酵工艺、保护剂参数以及冻干工艺，提供一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法，解决畜禽腹泻特别是幼龄动物的腹泻问题。
[0008]本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
[0009]本发明提供的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法，其步骤如下:
[0010]a.原始出发菌株布拉酵母(Saccharomyces boulardii)划线在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养上，30 0C，静置培养48h进行活化；
[0011]b.从斜面上挑取一环菌体，接种到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30°C，200-250rpm，培养12_16h，作为种子液，在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，以10%的接种量接种种子液，30°C，800rpm，培养12h，然后流加25%葡萄糖6h，流加量为20ml/h/L发酵液；
[0012]c.5000rpm，30min，收集菌体，加入保护剂混，保护剂与菌体混合比例为2: 1，混匀后静置平衡Ih ；
[0013]d.-80°C预冷12h，然后置于真空冷冻干燥机中冻干菌体，称取冻干菌粉进行活菌计数。
[0014]本发明a中所述的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，是由200g去皮马铃薯洗净切块，加水800ml煮沸30min,四层纱布过滤,再加20g葡萄糖和20g琼脂,搅拌混勻后,定容至1000ml，分装试管，121°C蒸汽灭菌20分钟后取出试管摆斜面制得。
[0015]本发明a中所述的菌种为布拉酵母(ATCC MYA-796) I株。
[0016]本发明b中所述的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基和液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，是由IOg酵母浸出粉，20g蛋白胨于900ml水中，121°C蒸汽灭菌20min，加入115°C蒸汽灭菌15min的IOOml 20%葡萄糖溶液制得。
[0017]本发明c中所述的保护剂，是由8%甘油，7.5%脱脂奶粉，7.5%海藻糖和0.9%氯化钠制得。
[0018]本发明具有以下有益效果:
[0019]本发明所制备的防腹泻酵母活菌制剂的有效活菌数达1.4X 101(lCFU/g。与其他制备方法比较，本发明所用的方法对酵母菌体的影响与破坏较小。
(四)【具体实施方式】
[0020]本发明提供的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法的【具体实施方式】如下:
[0021]本实施例所用的菌株为布拉酵母(Saccharomyces boulardii),保藏于美国模式培养物保藏中心(ATCC MYA-796)。
[0022]a.200g去皮马铃薯洗净切块，加水800ml煮沸30min，四层纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，搅拌混匀后，定容至1000ml，分装试管，121°C蒸汽灭菌20分钟后取出试管摆斜面制得马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基；
[0023]b.原始出发菌株布拉酵母划线在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养上，30°C，静置培养48h进行活化；
[0024]c.1Og酵母浸出粉，20g蛋白胨于900ml水中，121°C蒸汽灭菌20min，加入115°C蒸汽灭菌15min的IOOml 20%葡萄糖溶液制得酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基和液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基；
[0025]d.从斜面上挑取一环菌体，接种到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30°C，200-250rpm，培养12_16h，作为种子液，在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，以10%的接种量接种种子液，30°C，800rpm，培养12h，然后流加25%葡萄糖6h，流加量为20ml/h/L发酵液；
[0026]e.5000rpm，30min，收集菌体，加入保护剂混，保护剂与菌体混合比例为2: 1，混匀后静置平衡Ih ；
[0027]f.-80°C预冷12h，然后置于真空冷冻干燥机中冻干菌体，称取冻干菌粉进行活菌
计数；
[0028]g.由上所述的饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法制作的酵母活菌制剂其活菌
计数达 1.4X101QCFU/g。
[0029]表1不同保护剂配方参数对冻干粉活菌数的影响
【权利要求】
1.一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法，其步骤为: a.原始出发菌株布拉酵母(Saccharomycesboulardii)划线在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养上，30 0C，静置培养48h进行活化； b.从斜面上挑取一环菌体，接种到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30°C，200-250rpm，培养12_16h，作为种子液，在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，以10%的接种量接种种子液，30°C，800rpm，培养12h，然后流加25%葡萄糖6h，流加量为20ml/h/L发酵液； c.5000rpm, 30min,收集菌体，加入保护剂混，保护剂与菌体混合比例为2: 1，混匀后静置平衡Ih ； d._80°C预冷12h，然后置于真空冷冻干燥机中冻干菌体，称取冻干菌粉进行活菌计数。
2.根据权利要求1所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法，其步骤a所述的活化菌体的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，是由200g去皮马铃薯洗净切块，加水800ml煮沸30min,四层纱布过滤,再加20g葡萄糖和20g琼脂,搅拌混勻后,定容至1000ml,分装试管，121°C蒸汽灭菌20分钟后取出试管摆斜面制得。
3.根据权利要求1所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法，其步骤a所述的菌种为布拉酵母(ATCC MYA-796) I株。
4.根据权利要求1所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法，步骤b所述的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基和液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，是由IOg酵母浸出粉，20g蛋白胨于900ml水中，121°C蒸汽灭菌20min，加入115°C蒸汽灭菌15min的IOOml 20%葡萄糖溶液制得。
5.根据权利要求1所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法，其步骤c所述的保护剂，是由8%甘油，7.5%脱脂奶粉，7.5 %海藻糖和0.9%氯化钠制得。
6.根据权利要求1-5任一项所述的饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法制作的酵母活菌制剂其活菌计数达1.4X 101(lCFU/g。
【文档编号】A23K1/00GK103652320SQ201210342459
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月17日 优先权日:2012年9月17日
【发明者】滕达, 王建华, 王秀敏, 管庆丰 申请人:中国农业科学院饲料研究所