专利名称：一株根际拮抗细菌多粘类芽孢杆菌yc0136及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株根际拮抗细菌多粘类芽孢杆菌YC0136及其应用，属于微生物技术领域，主要是ー株多粘类芽孢杆菌能有效促进烟株生长并诱导其系统抗性。
背景技术：
烟草黑胚病(Phytophthoraparasitica var. nicotianae)是我国发生最为严重的烟草土传病害之一，其造成的年均损失12303. 38万元，仅次于病毒病。目前我国主要采用甲霜灵等化学农药来防治该病，但是长期使用化学农药容易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降。此外，长期、反复和大量使用化学农药可引起土壌、水体和大气的污染，同时也杀伤了其他有益微生物、昆虫和畜禽，破坏了生态平衡。生物防治越来越受到人们的重 视，其中利用植物根际促生细菌(PGPR)防治土传病害成为生物防治的重要研究領域。利用PGPR诱导系统抗性使烟草具有对多种病害的抵抗能力在烟草生产中具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株根际拮抗细菌多粘类芽孢杆菌YC0136及其应用，目的是研究烟草黑胚病拮抗菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通过测定烟草抗性相关生理指标来探讨其对烟株系统抗性的诱导作用，为拮抗菌在烟草田间的应用提供理论依据。本发明是通过如下技术方案实现—株分离自贵州烟田根际土壤的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)菌株编号为YC0136,平板对峙实验中对烟草寄生疫霉(Phytophthora nicotianaevar.nicotianae)和烟草青枯病病原菌爺科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有很强的拮抗能力。该菌株分类命名为PaenibacilluspolymyxaYC0136,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。以菌株YC0136的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(27F :5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1495R :5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ )进行 PCR 扩增，得到约为I. 4kb的扩增产物，其核苷酸序列如SEQ NO. I所示。根据GenBank序列Blast比对，菌株YC0136与多粘类芽孢杆菌PaenibacilluspolymyxaDSM 8320 的 16S rDNA 序列相似性达 99%。结合菌株的生理生化特征，将YCO13 6初歩鉴定为多粘类芽孢杆菌，命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的菌落和菌体特征为在LB平板上培养24h后呈圆形不透明，微黄，表面干燥；产芽抱，卵圆形，芽孢囊膨大，G+，细胞杆状。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的生理生化特征为接触酶试验阳性，氧化酶实验阴性，硝酸盐还原试验阳性，淀粉水解试验阳性，吲哚试验阴性，柠檬酸盐利用试验阴性，运动性试验阳性，葡萄糖产酸，果糖产酸，蔗糖产酸，甘露醇产酸。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的培养条件为菌株活化采用LB培养基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml。摇瓶发酵采用豆芽汁培养基黄豆芽200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。30°C、170r/min摇瓶发酵培养3d。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制备微生物菌齐U。应用时，培养菌种，得菌悬液，作为液态肥料，菌悬液的浓度优选为I. OX IO8CfuAil。温室盆栽试验结果表明，烟草根际接种多粘类芽孢杆菌(Paenibocilluspolymyxa) YC0136显著降低了黑胚病病情指数，定植35d后温室相对防效达到95. 9%，防治效果好于甲霜灵锰锌，同时能够促进烟草的生长发育。对烟草根系发育的调查中发现接种拮抗菌能够促进烟草的根部生长，根系活力高于对照。接种YC0136后在不同时期测定了烟草叶片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL的活性和叶绿素、电解质相对渗透率等生理指标，发现拮抗细菌YC0136诱导系统抗性好于化学诱导因子(甲霜灵锰锌)，叶片中几 种防御酶活性和叶绿素含量均显著高于对照，电解质相对渗透率比对照有所降低，同时温室试验中发现接种拮抗菌的烟草花叶病发病率比对照有所降低，最高幅度可达33. 33%，以上结果证明生防细菌可诱导烟草产生系统抗性，增强烟草对病害的抵抗力。烟草定植60d时，生防细菌诱导系统抗性作用最为显著，此时也是烟草田间病害的高发期，诱导作用在烟草生长后期仍有一定体现。结果表明拮抗菌YC0136能有效防治烟草黑胫病、促进烟株生长，具有良好的应用潜力。保藏信息一株多粘类芽抱杆菌YC0136 (Paenibacilluspolymyxa),于 2012 年 8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号=CGMCCNO. 6475。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步的说明。实施例I菌株的特性及其鉴定(I)菌株的分离筛选土壤样品来自贵州烟田根际土壌。供试病原菌为烟草寄生疫霉(Phytophthoranicotianaevar. nicotianae)和烟草青枯病病原菌爺科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)。分离用培养基为马铃薯鹿糖培养基(PDA)和牛肉膏蛋白胨培养基(NA)。拮抗菌的分离采用样品梯度稀释法得到分离物。采用平板对峙法筛选拮抗菌将马铃薯蔗糖培养基倒平板，用接种锄将活化好的病原真菌切成黄豆粒般大小的块状，置于平板中央，于28°C培养2cT3d，待病原真菌长到直径为2cm时，用接种环挑取分离物，从靠近病原真菌的一侧沿与其生长方向相交的方向划线接种，每个培养皿接种6-8个试验菌，于28°C培养24tT48h，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。筛选得到ー株烟草根际拮抗菌，其分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YCO136,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(2)多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的菌落和菌体特征在LB平板上30°C培养24h后呈圆形不透明，微黄，表面干燥；产芽孢，卵圆形，芽孢囊膨大，G+，细胞杆状。(3)多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的生理生化特征接触酶试验阳性，氧化酶实验阴性，硝酸盐还原试验阳性，淀粉水解试验阳性，吲哚试验阴性，柠檬酸盐利用试验阴性，运动性试验阳性，葡萄糖产酸，果糖产酸，蔗糖产酸，甘露醇产酸。(4) 16S rDNA 序列分析 PCR 扩增 16S rDNA 序列采用常规方法提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，27F和1495R作引物扩增YCO136 的 16S rDNA 序列。PCR 反应条件为95°C 5min，94°C lmin，56°C lmin，72°C I. 5min,30个循环，72 °C延伸lOmin。用3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒(3S SpinAgaroseGel DNA purification kit)纯化 PCR 产物。16S rDNA序列测定及分析测序由上海博尚生物技术有限公司完成。测序结果用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析。16S rDNA基因序列提交GenBank，其登录号为EU430119. I。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明YC0136的16S rDNA序列与PaenibacilluspolymyxaDSM 8320的16S rDNA序列相似性达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析,将其鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。实施例2制备菌剂多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的最适培养条件为菌株活化采用LB培养基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml。摇瓶发酵采用豆芽汁培养基黄豆芽200g，蔗糖20g，蒸馏水lOOOmL。30°C、170r/min摇瓶发酵培养3d。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制备微生物菌齐U。在LB培养基上划线接种于30°C温箱培养过夜，然后取菌种接种至三角瓶液体豆芽汁培养基，30°C摇床转速为170r/min摇瓶发酵培养3d，得菌悬液，作为液态肥料，使用时进行稀释至菌悬液的浓度为I. OX 108CfU/ml最佳，最高稀释倍数可以达到200倍，稀释菌液作为液态肥料可以浸根、灌根或喷施。实施例3盆栽试验将烟草盆栽试验在日光温室内进行，设置三个处理，其中A处理接种多粘类芽孢杆菌(PaenibaCilluSpOlymyXa)YC0136菌液；B处理为施加甲霜灵锰锌作为药剂对照；C处理为发病对照。每处理五次重复，每重复三棵烟苗。选择长势一致的5-6片真叶期的烟苗，移栽前将烟草幼苗在I X 108CFU/mL浓度的YC0136菌液中浸根30min，然后将烟苗移栽至盆中，药剂对照和发病对照采用培养基浸根。缓苗3天后用移液枪头将相应的YC0136菌悬液(I X 108CFU/mL)灌入烟株根际，每株烟4mL菌液，同时取ImL菌液淋于茎基部，发病对照接入等量培养基，药剂对照采用58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂500倍稀释液浇灌处理，每盆150mL。Id后将配制好的黑胫病游动孢子菌悬液(IO4个/mL)灌接于各处理烟苗根部，接种量为5mL/株。其余按照温室常规管理，浇水保湿以利于发病。(I)拮抗菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136对烟草病害的防治效果表I拮抗菌对烟草黑胫病温室防效
权利要求
1.一株保藏编号为CGMCC NO. 6475的根际拮抗细菌多粘类芽孢杆菌YC0136(Paenibacilluspolymyxa),其特征在于已于2012年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.如权利要求I所述的根际拮抗细菌多粘类芽孢杆菌YC0136在烟草中的应用，可防治烟草黑胫病、促进烟草根系的发育，提高烟草的根系活力，促进烟株生长。
全文摘要
本发明涉及一株根际拮抗细菌多粘类芽孢杆菌YC0136及其应用，目的是研究烟草黑胫病拮抗菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通过测定烟草抗性相关生理指标来探讨其对烟株系统抗性的诱导作用，为拮抗菌在烟草田间的应用提供理论依据；本发明分离得到的菌株能有效防治烟草黑胫病、促进烟株生长，具有良好的应用潜力。
文档编号C05F11/08GK102851250SQ20121034806
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者丁延芹, 姚良同, 杜秉海 申请人:山东农业大学, 德州创迪微生物资源有限公司