专利名称：香花槐高效组织培养和工厂化繁育的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养及扩大繁殖技术领域，具体涉及ー种香花槐的组织培养方法及工厂化扩大繁殖的方法。
背景技术：
香花槐(Robinia pseudoacacia cv.1daho)又名富贵树,属蝶形花科落叶乔木,原产于西班牙。香花槐树皮褐色，光滑。株高10-12米，叶互生，光滑，鲜绿色。总状花序腋生，作下垂状，长8-12厘米，花红色，芳香，在北方毎年5月和7月开两次花，在南方每年开3-4次花。花期在五月份是30天左右、七月份20天左右、八月份15天左右、九月份10天左右，具有花朵大、花形美、花量多、花期长等特点。花不育，无荚果，不结种子。香花槐性耐寒，能抗零下25度至零下28度低温。耐干旱、耐瘠薄、耐盐碱，对土壌要求不严，酸性土，中性土及轻盐碱土均能生长。根系十分发达，萌芽性强，生长快。香花槐叶体厚，具有较强的抗污染能力，对城市不良环境有耐性。香花槐为稀有的香花树种，集绿化、香化、美化于一身。她的花色艳丽，芳香浓郁，且花量多，花期长，一年开两次花；树形苍劲，姿态优美，可以广泛用于园林及行道緑化，香花槐对铅蒸汽的吸收和粉尘吸附能力强，对环境保护与空气净化的功能显著，香花槐被誉为21世纪黄金树，为园林緑化首推速生观赏树种。利用香花槐抗早、耐寒、速生、根系发达特点，可与其它树种配合在风沙、干旱地区大面积造林,对防风固沙，改善生态环境具有突出的作用。由于香花槐不结荚果，无种子可供繁殖，现有技术是靠埋根繁殖、枝条扦插、嫁接繁殖和组培繁殖等无性繁殖方法繁育。上述四种无性繁殖方法，无论从繁殖速度还是繁育成本最低的方法是组织培养法。有关香花槐的组织培养研究的报道较多，研究的重点是对诱导培养基、增值培养基和生根培养基的改进，以提高繁殖系数和生根率。由于香花槐具有广泛的应用价值和美好的发展前景，进ー步开展对香花槐组织培养的研究，提高其繁殖系数及成活率有着重要的意义
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种规模化的香花槐高效组织培养和エ厂化繁育的方法，应用该方法可使香花槐的继代繁殖达到15倍以上，使组培苗从组培室到温室的移栽成活率达到95%以上。本发明的目的是通过如下技术方案实现的。一种香花槐高效组织培养和エ厂化繁育的方法，包括以下步骤:
(I)诱导培养
1)按MS + 6-BA 0.6-0.8 mg/L + KT 0.02-0.05 mg/L + IAA 0.05-0.1 mg/L 培养基配方配制成诱导培养基母液；
2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%-0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调配为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体诱导培养基；3)取香花槐当年生枝条，消毒后取0.5mm大小的茎尖部分，接种到诱导培养基上，每培养瓶接种I个茎尖；
4)将接种好的培养瓶放到光照強度1500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养28天，得香花槐愈伤组织块，备用。(2)愈伤组织培养
I)按MS + 6-BA 0.3-0.5 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IM 0.1-0.15 mg/L + NM
0.08-0.1 mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L培养基配方配制成愈伤组织培养基母液；
2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%_0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调配为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体愈伤组织培养基;
3)将诱导培养得到的香花槐愈伤组织块在无菌环境下切成0.4-0.6 cm的小块，接种到愈伤组织培养基上，每培养瓶接种6-8块； 4)将接种好的培养瓶放到光照强度2500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养25天，得香花槐愈伤组织分化苗，备用。(3)继代培养
I)按MS + 6-BA 0.2-0.3 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3 1-1.2mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L +鹿糖5 g/L培养基配方配制成继代培养基母液；
2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%_0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体继代培养基；
3)将愈伤组织培养得到的愈伤组织分化苗在无菌环境下按一芽ー节切段，接种到继代培养基上，每培养瓶接种8-10节段；
4)将接种好的培养瓶放到光照强度2500-3500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养25天，得香花槐继代培养苗，备用。(4)生根培养
1)按MS+ IBA 1.0-1.2 mg/L +NAA 0.01-0.02 mg/L + GA3 10.2-10.3 mg/L + 多效唑2.0-2.2 mg/L培养基配方配制成生根培养基母液；
2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%_0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体生根培养基；
3)将继代培养得到的培养苗在无菌环境下按两芽ー节切段，接种到生根培养基上，每培养瓶接种9-10节段；
4)将接种好的培养瓶放到光照强度2000-2500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养15天，得香花槐生根苗，备用。(5)组织培养生根苗驯化
I)将装有组织培养生根苗的培养瓶移到大棚中，不开瓶驯化，驯化条件是:光照強度2000-40001x, 18-300C ，驯化 72h ；
2)将培养瓶打开瓶盖驯化，驯化条件是:光照强度2000-40001x，18-30°C，培养瓶内的相対湿度在90%以上，驯化48h。(6)组织培养生根苗移栽
I)把草炭土爆晒后过筛，将草炭土、蛭石、和细砂按体积比4:1:1的比例混合，用0.2%的高锰酸钾喷洒拌均，然后用塑料膜覆盖24h以上进行消毒，得到栽植基质，将栽植基质装入营养钵，备用；
2)将驯化好的组织培养生根苗从培养瓶中取出，洗掉培养基，栽入装有栽植基质的营养钵，做到根尖朝下、茎直立、浅埋、轻压、抹平；
3)将栽好苗的营养钵排放在大棚中，大棚环境条件控制在18-30°C、相対湿度70%-90%、光照强度2000-10000LX，开始7天内通风时间要短、通风频率要高，7天后逐渐加大通风量，组织培养生根苗在大棚中驯化23-25天。本发明的有益效果(I)采用本发明的诱导培养基，并在光照強度1500LX、23-28°C的条件下、每天光照14h诱导培养培养28天，然后采用本发明的愈伤组织培养基，在光照強度2500Lx、23-28°C的条件下、每天光照14h愈伤组织培养25天，再采用本发明的继代培养基，在光照强度2500-3500Lx、23-28°C的条件下、每天光照14h继代培养25天后，组培苗的增值达到了 15.2倍，比现有技术文献报道的组培苗增值6倍提高了 2.5倍；(2)采用本发明的生根培养基，首先在光照强度2000-2500Lx、23-28°C的条件下、每天光照14h，生根培养15天，平均单株生根达到3条，然后按本发明的条件对组织培养瓶苗进行驯化，最后将组织培养瓶苗移栽到本发明的草炭土、蛭石、和细砂按体积比4:1:1的比例、消过毒的栽植基质上，按照本发明的组织培养瓶苗移栽条件进行规范化管理，移栽到大田营养钵苗的成活率达到了 95%以上，较现有技术报道的90%提高了 5个百分点；(3)经过两年多繁殖500多万株香花槐种苗生产的比较，采用本发明的方法较改进前的组织培养基、培养条件以及驯化方法降低生产成本6.7%。实施例1
(I)培养基的制备将培养瓶洗浄，再用纯净水冲洗，将琼脂、培养基混合，加水定容，取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%-0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调为PH6，每个培养瓶装入20±3 ml，然后将培养瓶装入灭菌锅，在121_122°C条件下灭菌20-22min，冷却后，培养瓶出锅时做好相关标记。各种功能的培养基的配方分别是:
A 诱导培养基配方:MS + 6-BA 0.6 mg/L + KT 0.05 mg/L + IAA 0.05 mg/L ；
B 愈伤组织培养基配方:MS + 6-BA 0.5 mg/L + KT 0.05 mg/L + IAA 0.15 mg/L +NAA 0.08 mg/L + 砸酸 6.8 mg/L ；
C 继代培养基配方:MS + 6-BA 0.2 mg/L + KT 0.08 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3
1.2 mg/L + 硼酸 7.0 mg/L + 鹿糖 5 g/L ；
D 生根培养基配方:MS + IBA 1.2 mg/L +NAA 0.01 mg/L + GA3 10.3 mg/L + 多效唑
2.0 mg/Lo(2)茎尖培养在5月份取健壮的香花槐当年生枝条，剪去叶片，自来水冲洗IOmin,取饱满芽，依次用饱和洗衣粉水加吐温80刷洗、自来水冲洗干净、用75%的酒精、
0.1%升萊浸泡lOmin、无菌水冲洗5次,放入无菌培养皿内。在无菌条件下，在解剖镜下切取0.5 mm大小的茎尖部分，接种到诱导培养基上，每培养瓶接种I个茎尖。将接种好的培养瓶放到光照強度1500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养28天，得香花槐愈伤组织块。
(3)愈伤组织培养将诱导培养得到的愈伤组织块在无菌环境下切成0.4-0.6 cm的小块，接种到愈伤组织培养基上，每培养瓶接种6-8块，将接种好的培养瓶放到光照强度2500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养25天，得到香花槐愈伤组织分化苗。(4)继代培养将愈伤组织培养得到的愈伤组织分化苗在无菌环境下按一芽一节切段，接种到继代培养基上，每培养瓶接种8-10节段，将接种好的培养瓶放到光照强度2500-3500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养25天，得香花槐继代培养苗。(5)生根培养将继代培养得到的培养苗在无菌环境下按两芽ー节切段，接种到生根培养基上，每培养瓶接种9-10节段，将接种好的培养瓶放到光照强度2000-2500LX、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养15天，得香花槐生根苗。(6)组织培养生根苗驯化首先将装有组织培养生根苗的培养瓶移到大棚中，不开瓶驯化，驯化条件是:光照強度2000-40001X，18-30°C，驯化72h ;然后将培养瓶打开瓶盖驯化，驯化条件是:光照强度2000-40001x，18-300C，培养瓶内的相対湿度在90%以上，驯化48h。(7)组织培养生根苗移栽把草炭土爆晒后过筛，将草炭土、蛭石、和细砂按体积比4:1:1的比例混合，用0.2%的高锰酸钾喷洒拌均，然后用塑料膜覆盖24h以上进行消毒，得到栽植基质，将栽植基质装入营养钵；将驯化好的组织培养生根苗从培养瓶中取出，洗掉培养基，栽入装有栽植基质的营养钵，做到根尖朝下、茎直立、浅埋、轻压、抹平；将栽好苗的营养钵排放在大棚中，大棚环境条件控制在18-30°C、相対湿度70%-90%、光照強度2000-10000Lx,开始7天内通风时间要短、通风频率要高，7天后逐渐加大通风量，组织培养生根苗在大棚中驯化23-25天，成活率达到95%以上，然后即可栽植到大田。实施例2
(I)培养基的制备培养基的制备方法同实施例1，各种功能的培养基的配方分别
是:
A 诱导培养基配方:MS + 6-BA 0.8 mg/L + KT 0.02 mg/L + IAA 0.1 mg/L ；
B 愈伤组织培养基配方:MS + 6-BA 0.3 mg/L + KT 0.08 mg/L + IAA 0.1 mg/L + NM
0.1 mg/L + 硼酸 7.0mg/L ；
C 继代培养基配方:MS + 6-BA 0.3 mg/L + KT 0.05 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3lmg/L + 硼酸 6.8 mg/L+ 鹿糖 5 g/L ；
D 生根培养基配方:MS + IBA 1.0 mg/L +NAA 0.02 mg/L + GA3 10.2 mg/L + 多效唑
2.2 mg/し (2)茎尖培养、愈伤组织培养、继代培养、生根培养、组织培养瓶苗驯化、组织培养瓶苗移栽方法及条件同实施例1。
权利要求
1.一种香花槐高效组织培养和工厂化繁育的方法，包括以下步骤: (1)诱导培养1)按MS + 6-BA 0.6-0.8 mg/L + KT 0.02-0.05 mg/L + IAA 0.05-0.1 mg/L 培养基配方配制成诱导培养基母液； 2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%-0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调配为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体诱导培养基； 3)取香花槐当年生枝条，消毒后取0.5mm大小的茎尖部分，接种到诱导培养基上，每培养瓶接种I个茎尖； 4)将接种好的培养瓶放到光照強度1500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养28天，得香花槐愈伤组织块，备用； (2)愈伤组织培养 I)按MS + 6-BA 0.3-0.5 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IAA 0.1-0.15 mg/L + NM.0.08-0.1 mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L培养基配方配制成愈伤组织培养基母液；2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%_0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调配为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体愈伤组织培养基; 3)将诱导培养得到的香花槐愈伤组织块在无菌环境下切成0.4-0.6 cm的小块，接种到愈伤组织培养基上，每培养瓶接种6-8块； 4)将接种好的培养瓶放到光照强度2500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养25天，得香花槐愈伤组织分化苗，备用； (3)继代培养I)按MS + 6-BA 0.2-0.3 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3 1-1.2mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L +鹿糖5 g/L培养基配方配制成继代培养基母液；2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%_0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体继代培养基； 3)将愈伤组织培养得到的愈伤组织分化苗在无菌环境下按一芽ー节切段，接种到继代培养基上，每培养瓶接种8-10节段； 4)将接种好的培养瓶放到光照强度2500-3500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养25天，得香花槐继代培养苗，备用； (4)生根培养I)按MS + IBA 1.0-1.2 mg/L +NM 0.01-0.02 mg/L + GA3 10.2-10.3 mg/L + 多效唑2.0-2.2 mg/L培养基配方配制成生根培养基母液；2)取MS培养基配方质量0.65%-0.75%的琼脂、0.09%_0.10%的椰子汁与培养基母液混合均匀，将培养基调为PH6，在培养瓶中装入20±3 ml培养基，制成固体生根培养基； 3)将继代培养得到的培养苗在无菌环境下按两芽ー节切段，接种到生根培养基上，每培养瓶接种9-10节段； 4)将接种好的培养瓶放到光照强度2000-2500Lx、23-28°C的条件下，每天光照14h，培养15天，得香花槐生根苗，备用； (5)组织培养生根苗驯化I)将装有组织培养生根苗的培养瓶移到大棚中，不开瓶驯化，驯化条件是:光照強度2000-40001x, 18-30°C，驯化 72h ； 2)将培养瓶打开瓶盖驯化，驯化条件是:光照强度2000-40001x，18-30°C，培养瓶内的相対湿度在90%以上，驯化48h ； (6)组织培养生根苗移栽 1)把草炭土爆晒后过筛，将草炭土、蛭石、和细砂按体积比4:1:1的比例混合，用0.2%的高锰酸钾喷洒拌均，然后用塑料膜覆盖24h以上进行消毒，得到栽植基质，将栽植基质装入营养钵，备用； 2)将驯化好的组织培养生根苗从培养瓶中取出，洗掉培养基，栽入装有栽植基质的营养钵，做到根尖朝下、茎直立、浅埋、轻压、抹平； 3)将栽好苗的营养钵排放在大棚中，大棚环境条件控制在18-30°C、相対湿度70%-90%、光照强度2000-10000LX，开始7天内通风时间要短、通风频率要高，7天后逐渐加大通风量，组织培养生根苗 在大棚中驯化23-25天。
全文摘要
香花槐高效组织培养和工厂化繁育的方法，取香花槐当年生枝条，消毒后取茎尖接种到诱导培养基，培养得香花槐愈伤组织块；将愈伤组织块切成小块接种到愈伤组织培养基，培养得香花槐愈伤组织分化苗；将分化苗接种到继代培养基，培养得香花槐继代培养苗；将继代培养苗接种到生根培养基，培养得香花槐生根苗；将装有生根苗的培养瓶移到大棚中，先不开瓶驯化，再打开瓶盖驯化；把草炭土、蛭石、和细砂按一定比例混合，喷洒高锰酸钾和塑料膜覆盖消毒后，作为栽植基质装入营养钵；将驯化好的生根苗栽入营养钵，在大棚中驯化一段时间即可向大田移栽。采用本发明方法组培苗的增值达到了15.2倍，移栽到大田营养钵苗的成活率达到了95%以上，降低生产成本6.7%。
文档编号A01H4/00GK103081805SQ20131001070
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月13日 优先权日2013年1月13日
发明者王宇, 刘伟, 武时春, 乔晋萍, 翟春雷, 滕跃中, 苏彩霞, 牛鉴, 牛清 申请人:山西金贝植物科技开发有限责任公司