一种快速获取百合脱毒材料的方法
【专利摘要】本发明公开一种快速获取百合脱毒材料的方法，该方法通过一年生百合苗，在低温条件下处理后，采健壮茎尖，用洗衣粉加水搅动洗涤,流水条件下冲洗,晾干后放置备用，将清洗好的茎尖置于浓度75%的酒精溶液+0.1%升汞溶液+吐温80混合液中消毒7min,再用无菌水冲洗,用灭菌滤纸吸干水分后,在显微镜下剥取生长点，接种于固体MS培养基中进行培养，当继代培养叶片达到10-12片时，用RT-PCR方法对材料进行脱毒筛选，筛选出的脱毒材料就可进行脱毒苗的组培快繁。本发明提供的方法具有操作简便，脱毒率可达95%以上，脱毒材料成活率高、生长速率快等特点，提高了效率，节约了资源，具有广泛的实用性。
【专利说明】一种快速获取百合脱毒材料的方法发明领域
[0001]本发明涉及园艺生物【技术领域】，尤其涉及一种快速获取百合脱毒材料方法。
【背景技术】
[0002]传统百合获取脱毒材料的技术中，主要有茎尖培养脱毒法、热处理脱毒法和热处理结合茎尖培养脱毒法等。热处理脱毒法操作容易，但费时，脱毒不完全，植株存活率低；茎尖培养脱毒法脱毒率较高，但需在解剖镜下切取0.1-0.3mm茎尖，操作和培养困难；热处理与茎尖培养相结合的脱毒法比单纯的热处理和茎尖培养的脱毒率和植株成活率较高，是目前去除百合病毒较有效的方法，但这些方法效率不高，操作繁杂，脱毒材料成活率低，易污染，难以在短时间内获取脱毒材料。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于，提供一种快速获取百合脱毒材料的方法，该方法通过一年生百合苗，在低温条件下处理后，采健壮茎尖，用洗衣粉加水搅动洗涤，再流水冲洗，晾干后放置备用，将清洗好的茎尖置于75 %的酒精溶液+0.1 %升汞溶液+吐温80混合液中消毒，再用无菌水冲洗，用灭菌滤纸吸干水分后，在显微镜下剥取生长点，再接种于固体MS培养基中进行培养，当继代培养叶片达到10-12片时，用RT-PCR方法对材料进行脱毒筛选，筛选出的脱毒材料就可进行脱毒苗的组培快繁。本发明提供的方法适用于快速得到百合脱毒材料，进行百合脱毒苗的快繁生产，具有操作简便，脱毒率可达95%以上，脱毒材料成活率高、生长速率快等特点，提高了效率，节约了资源，具有广泛的实用性。克服了目前百合病毒用传统的脱毒方法效率不高，操作繁杂，脱毒材料成活率低，易污染，难以在短时间内获取脱毒材料的技术现状。极大地节约了获取脱毒材料过程中的水电和人力等资源。
[0004]本发明所述的一种快速获取百合脱毒材料方法，按下列步骤进行:
[0005]a、将一年生百合苗，在温度2-4°C的低温下处理20天；
[0006]b、将步骤a处理后的百合苗，采健壮茎尖，将茎尖用洗衣粉加水搅动洗涤lOmin，流水条件下冲洗2h，晾干后放置备用；
[0007]C、将清洗好的茎尖置于浓度为75%的酒精溶液20% +0.1 %升汞溶液80% +吐温802-3滴的混合液中消毒7min，再用无菌水冲洗4_5次，用灭菌滤纸吸干水分后，在显微镜下剥取0.5mm的生长点，接种于固体MS培养基中进行培养；
[0008]d、当继代培养叶片达到10-12片时，采用常规的RT-PCR方法对材料进行脱毒筛选。
[0009]本发明所述的一种快速获取百合脱毒材料方法，通过该方法获得的百合脱毒材料，采用常规的进行RT-PCR脱毒检测:
[0010]提取总核酸(RNA、DNA)
[0011]称取Ig幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，取约50mg转入1.5ml离心管中，加入500ul温度65°C预热的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液(用前加入2%的巯基乙醇)，将装有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和样品的EP管放入温度65°C水浴，约20s ；
[0012]冷却后，加入500ul的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 = 300:288:12，混匀，12000rpm离心15min,吸上清液,装入一新的EP管中；
[0013]加入500ul氯仿:异戍醇(24:1 = 576:24), 12000rpm离心15min吸上清液,转入一新的离心管中；
[0014]加入1/10体积的NaAc(3mol/l) lm，温度1_20°C预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于温度_20°C (-80°C，30min) 3_4h，12000rpm离心1min弃上清液；
[0015]向离心管中加入浓度75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干；
[0016]加入焦碳酸二乙酯(DEPC) H2O (50ul)溶解；
[0017]RT-PCR (两步法)
[0018]cDNA单链获得
[0019]多重PCR扩增
[0020]反应体系:10*PCR缓冲液 2ul 包括 MgCl2L 2ul、dNTP0.5ul、引物 2ul、Taq 酶(DNA聚合酶)0.5、反转录产物lul、总体积补足双蒸水至20ul ；
[0021]反应程序:预变性温度94 V 2min ;温度94 V 30s ;温度55 V 40s ；温度68 0C 2.5min, 35 个循环；温度 72°C 延伸 5min ；
[0022]用PTC-200扩增仪进行扩增，取PCR产物5ul，1.2 %琼糖凝胶电泳检测PCR产物；
[0023]确定脱毒材料，淘汰未脱毒材料:
[0024]备注:引物设计
[0025]根据NCBI Genebank (The Nat1nal Center for B1technology Informat1n,美国国立生物技术信息中心)中登录的百合18S rRNA和CMV、LMoV, LSV病毒基因序列，应用Primer premier 5.0软件分别设计18S rRNA和3种病毒的特异引物,引物核酸序列如下:
[0026]I) CMV (黄瓜花叶病毒)
[0027]TTGCGTTTCGTCTACTGGATCT(Upstream primer)
[0028]CAAAGGTTGGGTGGTTAATGG(Downstream primer)255bp
[0029]2) LMoV (百合斑驳病毒)
[0030]GTTCCAGGCAAATGAGACACTC(Upstream primer)
[0031]GTGCTAGATTGAAGTCGGTGAGA(Downstream primer)623bp
[0032]3) LSV (百合无症病毒)
[0033]ATGAAGGTTGGCGTCGTAT(Upstream primer)
[0034]CCTCAGCAGAAGTGGGTC(Downstream primer)439bp
[0035]4) 18s rRNA
[0036]CGCAAGGCTGAAACTTAAAGG(Upstream primer)
[0037]CAGACAAATCGCTCCACCAAC(Downstream primer)200bp
[0038]备注:试剂配制方法:
[0039]2X十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液(PH 8.0):2%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，1.4MNacl，0.02M乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-cl)，0.2%巯基乙醇；
[0040]称取十六烷基三甲基溴化铵2g，加蒸馏水40ml，加IM三羟甲基氨基甲烷缓冲液10ml, pH8.0,0.5M乙二胺四乙酸4ml，pH 8.0和5M NaCl 28ml,待十六烷基三甲基溴化铵溶解后用蒸馏水定容到10ml (提取前加入2%的巯基乙醇，10ml加0.2ml巯基乙醇);
[0041]将IM pH 8.0三羟甲基氨基甲烷缓冲液100ml:12.1lg三羟甲基氨基甲烷碱；ddH2080ml ；HC1 4.9ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调pH至8.0,定容至10ml ；
[0042]0.5M pH 8.0 乙二胺四乙酸 10ml:在 80ml 水中加入 18.0lg EDTANa2.2H20(乙二胺四乙酸二钠)搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0 (约2gNa0H颗粒)，定容至10ml ；
[0043]5M NaCl 10ml:称取 29.22g NaCl，用 ddH20 定容到 10ml ；
[0044]M NaAc 1ml:称取 2.46g NaAc，用 ddH20 定容到 1ml (ρΗ5.2)。
[0045]通过本发明所述快速获取百合脱毒材料方法，该方法具有操作简便，脱毒率可达95%以上，脱毒材料成活率高、生长速率快等特点，有效提高了获取脱毒材料的效率，极大地节约了获取脱毒材料过程中的水电和人力等资源。
【具体实施方式】
[0046]本发明并不限于下述的实施例，另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比。
[0047]本发明中选用的所有试剂、工具和仪器都为本领域熟知市售产品，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明的实施。
[0048]实施例1
[0049]将一年生百合苗，在温度2 V的低温下处理20天；
[0050]将处理后的百合苗，采健壮茎尖，将茎尖用洗衣粉加水搅动洗涤lOmin，流水条件下冲洗2h，晾干后放置备用；
[0051]将清洗好的茎尖置于浓度为75%的酒精溶液20% +0.1 %升汞溶液80% +吐温802-3滴的混合液中消毒7min，再用无菌水冲洗4次，用灭菌滤纸吸干水分后，在显微镜下剥取0.5mm的生长点，接种于固体MS培养基中进行培养；
[0052]当继代培养叶片达到10片时，用常规的RT-PCR方法对材料进行脱毒筛选；
[0053]RT-PCR 脱毒检测:
[0054]提取总核酸(RNA、DNA)
[0055]称取Ig幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，取50mg转入1.5ml离心管中，加入500ul温度65°C预热的十六烷基三甲基溴化铵溶液(用前加入2%的巯基乙醇)，将装有十六烷基三甲基溴化铵和样品的EP管放入温度65°C水浴，20s，冷却；
[0056]冷却后，加入500ul 的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1-300:288:12，混匀，12000rpm离心15min，吸上清液，装入一新的EP管中；
[0057]加入500ul氯仿:异戍醇=24:1-576:24,12000rpm离心15min,吸上清液,转入一新的离心管中；
[0058]加入1/10体积的NaAc (3mol/l) lm，温度1_20°C预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于温度_20°C (-80°C，30min) 3_4h，12000rpm离心，1min弃上清液；
[0059]向离心管中加入浓度为75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干；
[0060]加入焦碳酸二乙酯，H2O 50ul溶解；
[0061]RT-PCR (两步法):cDNA单链获得，多重PCR扩增；
[0062]反应体系:10*PCR缓冲液2ul包括MgCl2L 2ul、dNTP (脱氧核糖核苷三磷酸)0.5ul、引物2ul、Taq酶(DNA聚合酶)0.5、反转录产物lul、总体积补足双蒸水至20ul ；
[0063]反应程序:预变性温度94 V 2min ;温度94 V 30s ;温度55 V 40s ；温度68 0C 2.5min, 35 个循环；温度 72°C 延伸 5min ；
[0064]用PTC-200扩增仪进行扩增，取PCR产物5ul，1.2 %琼糖凝胶电泳检测PCR产物；
[0065]确定脱毒材料，淘汰未脱毒材料，将筛选出的脱毒材料进行脱毒苗的组培快繁。
[0066]实施例2
[0067]将一年生百合苗，在温度4°C的低温下处理20天；
[0068]将处理后的百合苗，采健壮茎尖，将茎尖用洗衣粉加水搅动洗涤lOmin，流水条件下冲洗2h，晾干后放置备用；
[0069]将清洗好的茎尖置于浓度为75%的酒精溶液20% +0.1 %升汞溶液80% +吐温802-3滴的混合液中消毒7min，再用无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干水分后，在显微镜下剥取0.5mm的生长点，接种于固体MS培养基中进行培养；
[0070]当继代培养叶片达到10-12片时，采用常规的RT-PCR方法对材料进行脱毒筛选；
[0071]RT-PCR 脱毒检测:
[0072]提取总核酸(RNA、DNA)
[0073]称取Ig幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，取50mg转入1.5ml离心管中，加入500ul温度65°C预热的十六烷基三甲基溴化铵溶液(用前加入2%的巯基乙醇)，将装有十六烷基三甲基溴化铵和样品的EP管放入温度65°C水浴，20s，冷却；
[0074]冷却后，加入500ul 的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1-300:288:12，混匀，12000rpm离心15min，吸上清液，装入一新的EP管中；
[0075]加入500ul氯仿:异戍醇=24:1-576:24,12000rpm离心15min,吸上清液,转入一新的离心管中；
[0076]加入1/10体积的NaAc (3mol/l) lm，温度1_20°C预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于温度_20°C (-80°C，30min) 3_4h，12000rpm离心，1min弃上清液；
[0077]向离心管中加入浓度为75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干；
[0078]加入焦碳酸二乙酯，H2O 50ul溶解；
[0079]RT-PCR (两步法):cDNA单链获得，多重PCR扩增；
[0080]反应体系:10*PCR缓冲液2ul包括MgCl2L 2ul、dNTP (脱氧核糖核苷三磷酸)0.5ul、引物2ul、Taq酶(DNA聚合酶)0.5、反转录产物lul、总体积补足双蒸水至20ul ；
[0081]反应程序:预变性温度94 V 2min ;温度94 V 30s ;温度55 V 40s ；温度68 0C 2.5min, 35 个循环；温度 72°C 延伸 5min ；
[0082]用PTC-200扩增仪进行扩增，取PCR产物5ul，1.2 %琼糖凝胶电泳检测PCR产物；
[0083]确定脱毒材料，淘汰未脱毒材料，将筛选出的脱毒材料进行脱毒苗的组培快繁。
[0084]实施例3
[0085]将一年生百合苗，在温度3°C的低温下处理20天；
[0086]将处理后的百合苗，采健壮茎尖，将茎尖用洗衣粉加水搅动洗涤lOmin，流水条件下冲洗2h，晾干后放置备用；
[0087]将清洗好的茎尖置于浓度为75%的酒精溶液20% +0.1 %升汞溶液80% +吐温802-3滴的混合液中消毒7min，再用无菌水冲洗4次，用灭菌滤纸吸干水分后，在显微镜下剥取0.5mm的生长点，接种于固体MS培养基中进行培养；
[0088]当继代培养叶片达到10-12片时，采用常规的RT-PCR方法对材料进行脱毒筛选。
[0089]RT-PCR 脱毒检测:
[0090]提取总核酸(RNA、DNA)
[0091]称取Ig幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，取50mg转入1.5ml离心管中，加入500ul温度65°C预热的十六烷基三甲基溴化铵溶液(用前加入2 %的巯基乙醇)，将装有十六烷基三甲基溴化铵和样品的EP管放入温度65°C水浴，20s，冷却；
[0092]冷却后，加入500ul 的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1-300:288:12，混匀，12000rpm离心15min，吸上清液，装入一新的EP管中；
[0093]加入500ul氯仿:异戍醇=24:1-576:24,12000rpm离心15min,吸上清液,转入一新的离心管中；
[0094]加入1/10体积的NaAc (3mol/l) lm，温度1_20°C预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于温度_20°C (-80°C，30min) 3_4h，12000rpm离心，1min弃上清液；
[0095]向离心管中加入浓度为75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干；
[0096]加入焦碳酸二乙酯，H2O 50ul溶解；
[0097]RT-PCR (两步法):cDNA单链获得，多重PCR扩增；
[0098]反应体系:10*PCR缓冲液2ul包括MgCl2L 2ul、dNTP (脱氧核糖核苷三磷酸)0.5ul、引物2ul、Taq酶(DNA聚合酶)0.5、反转录产物lul、总体积补足双蒸水至20ul ；
[0099]反应程序:预变性温度94 V 2min ;温度94 V 30s ;温度55 V 40s ；温度68 0C 2.5min, 35 个循环；温度 72°C 延伸 5min ；
[0100]用PTC-200扩增仪进行扩增，取PCR产物5ul，1.2 %琼糖凝胶电泳检测PCR产物；
[0101]确定脱毒材料，淘汰未脱毒材料，将筛选出的脱毒材料进行脱毒苗的组培快繁。
【权利要求】
1.一种快速获取百合脱毒材料方法，其特征在于按下列步骤进行: a、将一年生百合苗，在温度2-4°C的低温下处理20天； b、将步骤a处理后的百合苗，采健壮茎尖，将茎尖用洗衣粉加水搅动洗涤lOmin，流水条件下冲洗2h，晾干后放置备用； C、将清洗好的茎尖置于浓度为75%的酒精溶液20%+0.1%升汞溶液80%+吐温80 2-3滴的混合液中消毒7min，再用无菌水冲洗4-5次，用灭菌滤纸吸干水分后，在显微镜下剥取0.5mm的生长点，接种于固体MS培养基中进行培养； d、当继代培养叶片达到10-12片时，采用常规的RT-PCR方法对材料进行脱毒筛选。
【文档编号】A01H4/00GK104303998SQ201410424994
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】廖晴, 周斌, 玛尔哈巴·吾斯满, 刘巧玲, 池文泽, 盛玮, 蒋腾 申请人:新疆林业科学院, 新疆农业科学院园艺作物研究所