本发明属于现在农业高新技术领域，涉及一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，具体地说，涉及一种能够将籼稻内细菌性基腐病抗性遗传物质高效而专一地渗入粳稻、使得细菌性基腐病抗性粳稻育种周期大大缩短的育种方法。
背景技术：
水稻细菌性基腐病（Dickeya zeae）是水稻上危害较为严重的细菌性病害之一，该病于1979年首次在日本报道之后，在中国、菲律宾、印度、印尼、孟加拉国和朝鲜等东南亚一些国家都有发生，现已成为印度水稻上重要细菌病害之一。中国20世纪60年代初，水稻细菌性基腐病在我国福建省福鼎县造成严重危害，由于是新发生的病害，对于病原、发生流行规律及防治方面的知识不是很清楚，后来此病被确认为水稻细菌性基腐病。此后，浙江、江苏、江西、湖南、湖北、安徽、广西、上海、四川、贵州、云南、福建、海南、广东、黑龙江等省区都有报道发生。由于水稻细菌性基腐病具有突发性、偶发性和严重性等特点，是当前中国水稻生产的潜在威胁。近年来，水稻细菌性基腐病在我国多个省、区、市均有发生，且有扩散蔓延和逐年加重的趋势，且罹病水稻分蘖减少，茎基部腐烂，产生白穗、秕谷，严重的可造成水稻大面积失收，因此细菌性基腐病成为水稻高产、稳产的严重障碍，严重威胁着我国的粮食安全。
水稻细菌性基腐病在水稻整个生育期均可发生。在种子萌发的时候侵入，病菌的侵入会使种子或萌芽腐烂。在水稻的分蘖期至灌楽期均可发病，发病植株的莲基部先是变褐，到后来会变黑腐烂，腐烂部位有恶臭味。一般田间刚开始见病的时候，病株在田间呈零星分布。分蘖期发病的水稻病株，最初是心叶青卷，之后心叶枯黄，基部开始变褐腐烂；在水稻圆杆拔节期发病时，近水面的叶鞘边缘为褐色、叶片中间有长条形的青灰色病斑，叶片自下而上逐渐变黄；在水稻孕穗期以后发病，病株先失水青枯，有的病株会出现青枯死苗现象，一部分植株形成枯孕穗、半枯穗或枯穗，病株基部腐烂的部位加大，并伴随有少量倒生根。由于该病症状类似螟虫危害或生理性青枯，易导致该病的诊断失误，从而延误该病的发现时间，不能及时通报，这也是该病目前报道较少的重要原因之一。
水稻细菌性基腐病菌之前属于菊欧文氏菌属玉米致病变种，该病菌可以引起莲杆腐烂，该病菌在日本、中国、印度等国家发现可以侵染水稻基部，并且会导致基部腐烂，之前根据生理、生化特征将该病菌归入菊欧文氏菌属（Envinia chrysanthemi）。之后，通过分子序列分析后，该菌的分类地位一直处于争论之中，新的提议是将该菌归入一个新种Dickeya zeae。水稻细菌性基腐病菌菌体单生，短杆状，两端钝圆，具周生鞭毛，无芽胞和荚膜，革兰氏染色为阴性，细菌在牛肉浸膏蛋白腺琼脂培养基上培养菌落颜色初乳白色后变为土黄色，菌落呈变形虫状，表面稍皱缩，无光泽；刘琼光等的研究表明水稻细菌性基腐病菌生长的最适温度为32℃，最低温度为12℃，最高为4℃，致死温度为53℃，陈建斌等的研究表明水稻细菌性基腐病菌的致死温度为58℃。
水稻细菌性基腐病菌可在病稻草、病残体上越冬，在稻田的土壤和水中也可分离到此病菌的存在。采用伤根接种方法接种水稻后，发现病菌侵入水稻后主要存在于水稻的莲基部，病菌在根部也有所分布，病菌由根部向莲基部转移。因此在播种水稻种子或移栽秧苗后，一旦根系被损伤，病菌就有可能侵入，发生病害。另外，远距离调运水稻种子，气候条件，水稻品种之间的差异，偏施氮肥，病菌沿灌渠随水流传播，秧苗素质，移栽方式等因素均可导致水稻细菌性基腐病的传播与发生。
对于植物上病害的防治一般要采取“农业防治为主，化学防治为辅”的综合防治技术，水稻细菌性基腐病的防治要重点抓好种子处理，测土配方施肥，培育壮秧，发现病株时正确用药，科学管水等措施，在病害发生后可以有效控制该病扩散蔓延。加强一些农业防治措施,比如搞好种子处理、培育健壮秧苗、合理施用肥料、科学肥水管理等，农业防治措施对于病害的防治同样起着关键的作用。在进行农业防治的同时，适当地展药剂防治，可以更好地控制该病的发生危害。
选用抗病品种是防治病害最为有效的方法，目前，抗病品种的选育的途径被广泛地选择，对于水稻细菌性基腐病防治的抗病品种筛选试验发现，不同的水稻品种发病程度有着明显差异。20世纪80年代，南京农业大学采用浸根接种法对622个水稻品种进行抗病性测定表明，抗病品种占54.2%，感病品种占45.8%，籼稻抗病资源较多，而粳稻品种大多感病。华南农业大学刘琼光等对来自广东省各地培育出的共42个新品种和推广的栽培品种进行了抗病性鉴定，亦鉴定出Ⅱ优128、特优63、培杂72、培杂77、博优713等5个表现为高抗细菌性基腐病的籼性材料。
然而，目前通常所采用的常规育种的周期很长，培育出一个水稻细菌性基腐病菌抗性品种往往需要6-8年的努力，而又由于细菌性基腐病病菌生理小种遗传的复杂性和致病性的多样性使得病菌群体的毒力基因的组成发生变化，往往选育的抗性品种在推广3-5年后即产生能侵染该品种的优势小种，最终导致新品种的抗性丧失。常规育种消耗时间长，尤其随着细菌性基腐病病菌突变频率的增加，一个新品种育成的速度已经跟不上细菌性基腐病病菌的突变速度。
随着生物技术的发展，转基因育种与分子标记辅助选择等分子技术育种是目前农业发展的新道路。对特定优良主栽品种进行细菌性基腐病抗病基因和其他优良基因的转基因育种是一种可选方案，但由于目前转基因育种被抵制，且转基因育种和分子标记辅助选择育种首先需要基因定位，同样需要大田多世代的杂交回交，不能解决籼粳交的问题，另外，分子技术育种，都存在费用高、技术门槛高的问题，难以被一般育种者所掌握，能否设计一种将籼稻细菌性基腐病抗性遗传物质特定而高效的转移进粳稻实现粳稻细菌性基腐病抗病育种成为迫切需要解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现在细菌性基腐病抗性粳稻育种中存在育种周期长、筛选效率低的缺点，提供了一种能够将籼稻内细菌性基腐病抗性遗传物质高效而专一地渗入粳稻、育种周期大大缩短的细菌性基腐病抗性粳稻育种方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：
（1）选取待改良粳稻材料和细菌性基腐病籼稻抗源：选取农艺性状良好、细菌性基腐病抗性有待改良的粳稻材料并将该粳稻花药接种至排籼培养基上诱导培养，最终选择花药愈伤组织诱导率高于35%的粳稻材料作为待改良粳稻材料，选取农艺性状良好且抗细菌性基腐病的籼稻材料作为细菌性基腐病籼稻抗源；
（2）对选取的待改良粳稻材料进行粗毒素耐性浓度的鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻材料诱导培养的花药愈伤组织转移进该分化培养基，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压；
（3）杂交获得三交F1杂交种：将大田种植的细菌性基腐病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻材料杂交获得杂交种三交F1；
（4）对三交F1杂交种再进行排籼培养基花药培养：三交F1杂交种正季播种，选取健壮饱满的花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.6～0.9cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基上，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下分化培养，获得花培幼苗，待花培苗苗高达到3cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗苗高达到8cm后移栽至周转箱中壮苗，10～15天后移栽入大田；
（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、细菌性基腐病抗性筛选获得粳稻新品系：大田种植花培苗，单株收种获得细菌性基腐病抗性得到改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田内小区种植，以待改良粳稻材料亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且细菌性基腐病抗性得到改良的粳稻新品系。
所述步骤（1）中的农艺性状良好、细菌性基腐病抗性有待改良的粳稻材料是指产量高、米质优良、细菌性基腐病抗性有待改良且株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻材料；所述的细菌性基腐病籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗细菌性基腐病的籼稻材料。
所述步骤（1）中花药接种至排籼培养基上诱导培养的过程如下：
（1.1）取材与预处理：将选取的粳稻材料大田常规栽培，以稻苞大而不破、剑叶叶枕距为5～8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的1/3～1/2为标准取穗，保留2～3张叶片，取穗时间一般选择在晴天上午9:00～12:00，取材后，用70%乙醇表面消毒，然后塑料薄膜包住整个稻穗，扎紧塑料袋口，保持稻穗湿润，最后放到冰箱中，在4℃下低温预处理3天；
（1.2）接种：预处理后，剪下稻苞，将稻苞浸泡于70%的酒精中处理3～5min，然后将该稻苞转移于超净工作台中剥离稻穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基；
（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于25～27℃下暗培养，30～40天后在花药的边缘出现淡黄白色的花药愈伤组织，并在花药接种培养45天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于35%的农艺性状良好的粳稻材料作为待改良粳稻材料。
所述步骤（1.2）中的稻苞是指稻苞顶枕距为8cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的部分，且剥取的小支梗上花药数量为15～25粒；所述的排籼培养基配方为：N6大量元素+MS微量元素+N6有机质+1.8mg/L2,4-D+0.4mg/LNAA+0.3mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.7%琼脂，pH值为6.0。
所述步骤（2）中的粗毒素提取液的制备过程为：选择细菌性基腐病强致病力产毒素菌株Ech7作为粗毒素的来源，将菌株接种于无蛋白培养液，30℃振荡培养24h，然后将细菌菌液在4℃下10000×g离心15 min，所得黄色上清液即水稻细菌性基腐病粗毒素。
所述步骤（2）中的分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+3%蔗糖+0.6%植物凝胶+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+一定梯度浓度的粗毒素提取液，pH值为6.0。
所述步骤（2）中的粗毒素选择压是指选定的待改良粳稻材料诱导培养的花药愈伤组织分化率为0.7%～1.3%时的所加入的一定浓度的粗毒素。
所述中的无蛋白培养液的配方为：每升无蛋白培养液含1mol/L的NaOH 9mL、10% CaCl2·2H2O 6mL，NaNO3 2g/L，蔗糖10g/L，K2HPO4 2g/L，KH2PO4 0.5g/L，蒸馏水1000mL，pH值为7.0。
所述步骤（4）中的三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于2.5%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮饱满的花药重新进行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于2.5%的花药愈伤组织，挑选直径0.6～0.9cm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗苗高达到3cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗苗高达到8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。
所述步骤（1）和（4）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+MS微量元素+N6有机质+1.8mg/L2,4-D+0.4mg/LNAA+0.3mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.7%琼脂，pH值为6.0；所述步骤（4）中的分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+3%蔗糖+0.6%植物凝胶+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+粗毒素选择压，pH值为6.0；所述步骤（4）中的生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+2%蔗糖+0.8%琼脂，pH值为6.0。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：
（1）选择待改良粳稻材料和细菌性基腐病籼稻抗源：
选取农艺性状良好、细菌性基腐病抗性有待改良的粳稻材料，由于籼粳交杂种F1代通常具有株高偏高、生育期超亲晚熟的特点，故选择的待改良粳稻材料是指产量高、米质优良、细菌性基腐病抗性有待改良且株高不宜过高、生育期早熟或中熟的粳稻材料；将该粳稻花药接种至排籼培养基上（配方为：N6大量元素+MS微量元素+N6有机质+1.8mg/L2,4-D+0.4mg/LNAA+0.3mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.7%琼脂，pH值为6.0）诱导培养，以检验该粳稻品材料是否适用于排籼培养基中进行花药诱导愈伤组织，诱导培养过程如下：
（1.1）取材与预处理：将选取的粳稻材料大田常规栽培，以稻苞大而不破、剑叶叶枕距为5～8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的1/3～1/2为标准取穗，保留2～3张叶片，取穗时间一般选择在晴天上午9:00～12:00，取材后，用70%乙醇表面消毒，然后塑料薄膜包住整个稻穗，扎紧塑料袋口，保持稻穗湿润，最后放到冰箱中，在4℃下低温预处理3天；
（1.2）接种：预处理后，剪下顶枕距为8cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的稻苞，将稻苞浸泡于70%的酒精中处理3～5min，然后将该稻苞转移于超净工作台中剥出稻穗，并将稻穗分离为大小均匀、花药数量为15～25粒的小支梗，然后用消毒过的纱布包住小支梗后投入浓度为0.1%的升汞中灭菌10min，灭菌完成后用无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基；
（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于25～27℃下暗培养，30～40天后在花药的边缘出现淡黄白色的花药愈伤组织，并在花药接种培养45天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于35%的农艺性状良好的粳稻材料作为待改良粳稻材料；
最终选择花药愈伤组织诱导率高于35%的粳稻材料作为待改良粳稻材料，选取农艺性状良好且抗细菌性基腐病的籼稻材料作为细菌性基腐病籼稻抗源，该籼稻抗源是指产量高、米质优良、高抗细菌性基腐病的籼稻材料；
（2）对选择的待改良粳稻材料进行粗毒素耐性浓度的鉴定：
（2.1）粗毒素的制备：选择细菌性基腐病强致病力产毒素菌株Ech7作为粗毒素的来源，将菌株接种于无蛋白培养液，30℃振荡培养24h，然后将细菌菌液在4℃下10000×g离心15 min，所得黄色上清液即水稻细菌性基腐病粗毒素；
（2.2）对选取的待改良粳稻材料进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基（配方为：MS无机盐+MS有机物+3%蔗糖+0.6%植物凝胶+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L，pH值为6.0）中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻材料诱导培养的花药愈伤组织转移进该分化培养基，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并将待改良粳稻材料诱导培养的花药愈伤组织分化率为0.7%～1.3%时的浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压；
（3）杂交获得三交F1杂交种：
将大田种植的细菌性基腐病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻材料杂交获得杂交种三交F1；
（4）对三交F1杂交种再进行排籼培养基花药培养：
三交F1杂交种正季播种，选取健壮饱满的花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，若该三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于2.5%时，需将三交F1杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮饱满的花药重新进行排籼培养基花药诱导培养（配方为：N6大量元素+MS微量元素+N6有机质+1.8mg/L2,4-D+0.4mg/LNAA+0.3mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.7%琼脂，pH值为6.0），直至获得诱导率不低于2.5%的花药愈伤组织。然后挑选直径0.6～0.9cm的花药愈伤组织接种于添加了粗毒素选择压的分化培养基（MS无机盐+MS有机物+3%蔗糖+0.6%植物凝胶+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+粗毒素选择压，pH值为6.0）上，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下分化培养，获得花培幼苗，待花培苗苗高达到3cm后转接于生根培养基（配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+2%蔗糖+0.8%琼脂，pH值为6.0）进行继代培养，待花培苗苗高达到8cm后移栽至周转箱中壮苗，10～15天后移栽入大田；
（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状鉴定、细菌性基腐病抗性筛选获得粳稻新品系：
大田种植花培苗，单株收种获得细菌性基腐病抗性得到改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田内小区种植，以待改良粳稻材料亲本为对照，筛选农艺形状良好且细菌性基腐病抗性得到改良的粳稻新品系。
本发明的育种方法与常规育种方法相比，能够将籼稻内细菌性基腐病抗性遗传物质高效而专一地渗入粳稻，大大减少了筛选工作量，3年左右即可完成细菌性基腐病抗性粳稻育种，大大缩短细菌性基腐病抗病育种周期，与分子技术育种相比，又具有操作门槛相对较低、花费较少的优点，具有较大的育种应用价值。
实施例
2010年～2013年，我们分别选择籼稻材料博优713作为细菌性基腐病抗源、育种主干品系J0118作为待改良粳稻材料，采用本发明的技术路线进行细菌性基腐病抗病育种，成功获得了3个农艺性状优良、细菌性基腐病抗性得到改良的花培家系，其具体操作流程如下：
（1）分别筛选J0118和博优713作为待改良粳稻材料和细菌性基腐病籼稻抗源：
多年的育种实践发现，育种主干品系J0118农艺性状优良，产量高、米质好、偏早熟，但较感细菌性基腐病，2010年正季将J0118取花药接种于排籼培养基进行诱导培养，结果发现J0118愈伤组织的诱导率为48%（花药培养操作步骤同前），较适合该技术路线的粳稻育种亲本的要求。博优713是汕头市农科所育成的籼型杂交稻，除高抗细菌性基腐病外，还具有株型适中、叶片厚直、茎秆坚实、分蘖力强、米质优、若感光等优点，非常适合作为本技术路线的细菌性基腐病籼稻抗源的要求。
（2）对J0118进行粗毒素耐性浓度的鉴定：
2010年正季对选取的J0118进行粗毒素耐力浓度鉴定，在分化培养基中加入5%、10%、15%、20%、25%的粗毒素提取液，配制分化培养基，分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+3%蔗糖+0.6%植物凝胶+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+梯度浓度粗毒素提取液，pH值6.0，然后将步骤（1）中诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，统计愈伤组织分化率。结果如下表：
因此，综合比较，我们将20%的粗毒素提取液浓度定为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压。
（3）杂交育种获得三交F1杂交种：
2010年博优713与矮秆广亲和粳稻02428杂交架桥，收获杂交种F1，2011年海南南繁选取F1花药再与J0118杂交获取杂交种三交F1。
（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：
2011年正季大田常规种植三交F1杂交种，选取健壮饱满穗子的花药接种于排籼培养基进行花药诱导培养获得花药愈伤组织，排籼培养基配方为：N6大量元素+MS微量元素+N6有机质+1.8mg/L2,4-D+0.4mg/LNAA+0.3mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.7%琼脂，pH值为6.0；并挑选直径0.6～0.9cm的花药愈伤组织接种于添加了20%粗毒素提取液的分化培养基中，分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+3%蔗糖+0.6%植物凝胶+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+20%的粗毒素提取液，pH值为6.0，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下继续分化培养，获得172棵花培幼苗；待花培苗苗高达到3cm后转接于生根培养基进行继代培养，1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+2%蔗糖+0.8%琼脂，pH值为6.0，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，2012年移栽入温室。
（5）花培家系大田种植，农艺性状、细菌性基腐病抗性筛选获得细菌性基腐病抗性改良的3个优良粳稻新品系：
移栽到温室的花培苗单株收种，获得146个花培家系，2013年正季进一步大田播种146个花培家系，以J0118为对照，从中筛选获得3个农艺形状优良且细菌性基腐病抗性得到改良的粳稻新品系。
由本实施例可见，本发明的育种方法与常规育种方法相比，能够将籼稻内细菌性基腐病抗性遗传物质高效而专一地渗入粳稻，大大减少了筛选工作量，仅用3年即可完成细菌性基腐病抗性粳稻育种，从而大大缩短细菌性基腐病抗病育种周期，而且操作门槛较低、花费较少，所以具有较大的育种应用价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。