一种苦苣苔科植物组织培养方法与流程

本发明涉及植物组织培养领域，具体的说是涉及一种苦苣苔科植物组织培养方法。

背景技术：

苦苣苔科(Gesneriaceae)植物多为多年生草本植物，种类繁多，全世界约有140属，2000余种，我国有58属463种。有的种类既耐旱又耐阴、耐湿，有的种类具有很高的药用价值，有的种类株型、叶形、花形变化丰富，花叶兼美，观赏价值高，具有一定的室内观赏盆花开发前景；但目前大多种类尚未进入商品开发阶段，且由于自身的遗传缺陷及野生资源的过度开发，很多具有较高应用价值的苦苣苔科植物已濒临灭菌。利用组织培养快速繁殖技术有助于苦苣苔科植物的商品开发和种质资源保存，还有利于苦苣苔科植物的良种选育、人工种子培育、生理代谢研究等工作的进一步开展。

目前，苦苣苔的组织培养技术已有较多报道，但是在众多的现有技术中，初代培养不定芽的分化率、继代增殖培养的增殖系数比较低，并且生根率也没有能够达到100％，如专利CN102144556A公开的瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法中，其不定芽分化率仅为31.7％，而繁殖系数仅为4.6/60d，生根率为90.7％；专利CN103141390A公开的红苞半蒴苣苔的繁殖方法，其记载的继代繁殖培养的增殖倍数为3.6倍；CN105325301A公开了一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法，其记载的不定芽分化率最高为86.9％，增殖系数最高为6.1/50d，生根率最高为89.5％/30d。CN104823855A公开的短毛唇柱苣苔组培快繁方法中，增殖系数为15，虽然有所提高，但是仍旧不高。此外，还有诸多苦苣苔科植物的组织快繁技术，但是由于在培养基的选择搭配上不够理想，致使在培养过程中，愈伤组织诱导率、不定芽分化率、增至培养的增殖系数以及生根率等各阶段的效果较差。因此，提供一种在各阶段具有较好快繁效果的组织培养方法，可以极大地推动苦苣苔科植物的经济效益。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种苦苣苔科植物组织培养方法，使得所述组织培养方法能够在培养过程中具备较高的愈伤诱导率、不定芽分化率、增殖系数和生根率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种苦苣苔科植物组织培养方法，包括：

步骤1、取苦苣苔科植物的外植体进行灭菌；

步骤2、将外植体接种到初代诱导培养基中，先进行暗培养诱导出愈伤组织，而后进行光培养分化出不定芽；所述初代诱导培养基采用如下之一：

(1)含有0.04mg/L的TDZ、0.2～0.8mg/L的2,4-D、0.1～0.3mg/L的NAA、20～25g/L的蔗糖的MS培养基，pH值为5.8-6.0；

(2)含有0.8mg/L的6-BA、0.08mg/L的KT、0.1mg/L的IAA、20～25g/L的蔗糖的MS培养基，pH值5.8-6.0；

步骤3、将分化出不定芽的芽块接种到继代培养基中进行增殖培养，获得丛生芽的有效苗，所述继代培养基为含有0.01mg/L的TDZ、0.4mg/L的6-BA、0.05mg/L的NAA、200mg/L的CH(即水解酪蛋白)的MS培养基，pH值5.8-6.0；

步骤4、将有效苗转接到生根培养基上进行生根培养，获得完整无菌苗，所述生根培养基为含有0.2mg/L的IBA、0.1mg/L的IAA、20g/L的蔗糖的1/2MS培养基，pH值为6.0～6.2。

对于植物组织培养，培养基是其生长状态的最关键因素之一，现有苦苣苔植物的组织培养方法由于对初代诱导分化、继代增殖以及生根三个阶段的培养基选择以及组合搭配不当，使得各阶段的愈伤诱导率、不定芽分化率、增殖系数和生根率都比较差，本发明选择特定的三个阶段培养基组成了一个成体系的苦苣苔植物快繁工艺，在每一个阶段都具有较好的效果。

作为优选，步骤1为取苦苣苔科植物的外植体用酒精和升汞进行灭菌。

进一步优选地，步骤1为：

取苦苣苔科植株的外植体，用自来水冲洗干净后，移入超净工作台，用75％酒精浸泡30～60s，无菌水清洗2次，然后用加2滴TWeen-20的0.1％HgCl₂溶液处理5min，无菌水清洗1次；再用加2滴TWeen-20的0.1％HgCl₂溶液处理2～5min，无菌水清洗5～6次，将外植体置于无菌滤纸上吸干水分，待用。

在本发明中，所述苦苣苔科植物优选为报春苣苔、旋朔苣苔或半蒴苣苔，其中包括多痕报春苣苔(Primulina minutihamata)、永福报春苣苔(Primulina yungfuensis)、药用报春苣苔(Primulina medica)、猪耳朵(Boea hygrometrica)、疏脉半蒴苣苔(Hemiboea cavalerei var.paucinervis)、武宣报春苣苔(Primulina wuxuanensis)。而所选用的外植体优选采用苦苣苔科植物的叶片和/或叶柄。其中，作为优选，多痕报春苣苔、永福报春苣苔、药用报春苣苔、猪耳朵采用含有0.04mg/L的TDZ、0.2～0.8mg/L的2,4-D、0.1～0.3mg/L的NAA、20～25g/L的蔗糖的MS培养基作为初代诱导培养基，pH值为5.8-6.0；疏脉半蒴苣苔、武宣报春苣苔采用含有0.8mg/L的6-BA、0.08mg/L的KT、0.1mg/L的IAA、20～25g/L的蔗糖的MS培养基作为初代诱导培养基，pH值5.8-6.0。

作为优选，所述暗培养在20～25℃下培养。所述光培养、增殖培养以及生根培养均优选在20～25℃、光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d下培养。

暗培养一般培养20～35d后，根据愈伤组织或芽的诱导分化情况将培养所得的愈伤组织或芽分别转接到原培养基上进行光培养；在增殖培养过程中，一般培养30d；而在生根培养中，一般培养1-2周。

本方法以6种苦苣苔植物的叶片和(或)叶柄为外植体材料，利用本发明组织培养技术和原理，经过愈伤组织诱导、分化及丛生芽增殖和生根的过程，快速获得多痕报春苣苔、武宣报春苣苔、永福报春苣苔、疏脉半蒴苣苔、药用报春苣苔、猪耳朵6种苦苣苔科植物无菌苗，其中愈伤组织诱导率高达90％以上，分化率达100％，增殖系数约50～120，生根率达100％。各阶段的效果数据均显著高于现有技术中相关苦苣苔科植物组织培养方法。

由以上技术方案可知，本发明选择特定的初代诱导培养基、继代培养基和生根培养基，利用组织培养技术，通过一种新途径获得了多痕报春苣苔、武宣报春苣苔、永福报春苣苔、疏脉半蒴苣苔、药用报春苣苔、猪耳朵等多种苦苣苔科植物的无菌苗，建立了稳定、高效的组培快繁体系。

附图说明

图1所示为多痕报春苣苔愈伤组织诱导及分化图；

图2所示为永福报苣苔春愈伤组织形成及分化图；

图3所示为药用报春苣苔愈伤组织形成及分化图；

图4所示为猪耳朵愈伤组织形成及分化图；

图5所示为疏脉半蒴苣苔愈伤组织形成及分化图；

图6所示为武宣报春苣苔愈伤组织形成及分化图；

图7所示为多痕报春苣苔丛生芽增殖图；

图8所示为永福报春苣苔丛生芽增殖图；

图9所示为药用报春苣苔丛生芽增殖及芽苗生根图；

图10所示为猪耳朵丛生芽增殖图；

图11所示为疏脉半蒴苣苔丛生芽增殖图；

图12所示为武宣报春苣苔丛生芽增殖图；

图13所示为多痕报春苣苔芽苗生根图；

图14所示为永福报春苣苔芽苗生根图；

图15所示为猪耳朵芽苗生根图；

图16所示为疏脉半蒴苣苔芽苗生根图；

图17所示为武宣报春苣苔芽苗生根图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种苦苣苔科植物组织培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述组织培养方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的组织培养方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种苦苣苔科植物组织培养方法做进一步说明。

实施例1：本发明所述苦苣苔科植物组织培养方法

外植体灭菌：

取研究用健康苦苣苔植株(多痕报春苣苔、武宣报春苣苔、永福报春苣苔、疏脉半蒴苣苔、药用报春苣苔、猪耳朵)的叶片和叶柄，用自来水冲洗干净后，移入超净工作台，用75％酒精浸泡30～60s，无菌水清洗2次，然后用0.1％HgCl₂(加2滴TWeen-20)溶液处理5min，无菌水清洗1次；再用0.1％HgCl₂(加2滴TWeen-20)溶液处理一次，叶片2～3min，叶柄3～5min，无菌水清洗5～6次。将叶片或叶柄置于无菌滤纸上吸干水分，叶片剪成0.5cm×0.5cm大小的块，叶柄切成0.5～1.0cm长的小段，待用。

愈伤组织诱导及不定芽分化：

将已灭菌并处理好的叶片，接种于初代诱导培养基中培养，培养温度20～25℃，先进行暗培养，待愈伤长出后进行光培养(光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d)。所用培养基为：(1)MS+TDZ 0.04mg/L+2,4-D 0.2～0.8mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L，用于多痕报春苣苔、永福报春苣苔、药用报春苣苔、猪耳朵的初代诱导培养；(2)MS+6-BA 0.8mg/L+KT 0.08mg/L+IAA 0.1mg/L，用于疏脉半蒴苣苔和武宣报春苣苔的初代诱导培养。其中培养基的蔗糖含量为20～25g/L，pH为5.8～6.0。

暗培养20～35d后，根据愈伤组织或芽的诱导分化情况将培养所得的愈伤组织或芽分别转接到原培养基上进行光培养，各苦苣苔诱导分化情况见图1-6。

增殖培养：

将初代培养所得的芽块分割成每块带1～2个芽的小块，转入继代培养基中进行增殖培养，培养温度20～25℃，光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d。所用培养基为：MS+TDZ 0.01mg/L+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.05mg/L+CH 200mg/L，pH为5.8～6.0。约30d后，每个瓶内的有效苗(长出3～4片叶，叶绿而平展，生长正常的小苗)数均达30～40株，各苦苣苔丛生芽增殖情况情况见图7-12。

生根培养：

将上述培养所得的无菌健壮有效苗转接到生根培养基上进行生根培养，培养温度20～25℃，光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d。所用培养基为：1/2MS+IBA 0.2mg/L+IAA 0.1mg/L，培养基糖含量为20g/L，pH为6.0～6.2。培养1～2周后，无菌芽苗开始生根，获得完整无菌苗，各苦苣苔生根情况见图13-17。

实施例2：组织培养试验

试验对象：多痕报春苣苔、武宣报春苣苔、永福报春苣苔、疏脉半蒴苣苔、药用报春苣苔、猪耳朵；

外植体：叶片和叶柄；

结果见表1。

表1

由表1结果可知，相比较现有专利的愈伤诱导率、不定芽分化率、丛生芽增殖系数以及生根率，本发明在各方面均达到了更优的效果，特别是丛生芽增殖系数是极其显著的高于当前各专利技术中的效果。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。