本发明涉及一种氧化石墨烯-纳米银复合抗菌剂的制备方法，具体是一种在水溶液中利用自组装将O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银均匀负载在氧化石墨烯表面的制备方法。
背景技术：
利用抗菌剂来抑制和杀灭有害细菌是提高人类健康水平的一个重要方法，传统的抗菌剂，如抗生素、季铵盐等不但会导致微生物的耐药性，还会造成严重的环境污染。纳米银由于具有较好的广谱抗菌性、不易产生耐药性等特点已逐步应用于生物医学及临床等相关领域。然而纳米银具有易团聚、易氧化及水溶性差等特点，使得其进一步应用受到限制。氧化石墨烯是一种准二维片层状碳质材料，其表面还含有较多的含氧官能团如羰基、羧基、羟基等。这些官能团的存在不仅使氧化石墨烯能够均匀的分散，而且为氧化石墨烯纳米银复合材料的形成提供了有利的结合位点，因此氧化石墨烯是一种理想的纳米银载体材料。
目前在已有的氧化石墨烯-纳米银抗菌剂大多采用银盐的络合反应或氧化石墨烯银离子混合液加还原剂还原的方法来制备。制备过程中含有大量的硝酸根、盐酸根及各种有机物等有毒物质，制造出来的纳米银溶液毒性很大，应用领域受到限制。
例如，公布号为CN105772739A的“一种石墨烯/纳米银复合抗菌材料的制备方法”的发明专利，该专利将吸附有银离子的氧化石墨烯放入还原剂溶液中加热处理，离心分离即得石墨烯/纳米银复合材料。但是该专利在制备过程中使用毒性较高的乙醛酸作为还原剂，使得在医用材料应用方面受到限制，易对人体健康产生威胁，同时制备过程中长时间的加热导致耗能过大。
技术实现要素：
针对目前现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提出一种低毒、安全和耗能小的壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料的制备方法。
上述目的是通过以下技术方案来实现的。
一种壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料的制备方法，所述制备方法是按下列步骤进行的：
(1) 将0.1%wt的硝酸银溶液与0.1%wt 的O-羧甲基壳聚糖溶液按体积比为20:80-1:99进行混合，室温搅拌0.5-1h；
(2) 将上述混合溶液置于4mL石英比色皿中，通氮气20s除尽空气并密封；
(3) 将石英比色皿置于272nm紫外灯5cm处照射15min，紫外灯功率20w；
(4) 将混合溶液中加入一倍体积无水乙醇在14000r/min转速下离心60min取沉淀，并用50%wt乙醇离心洗涤两次；
(5) 沉淀再次溶于超纯水，并超声处理5-10min，即得O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液；
(6) O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液与氧化石墨烯分散液按体积比为1:5-5:1混合，超声处理5-10min。
在上述技术方案中，所述超声处理为水浴超声处理或探头超声处理；所述硝酸银被还原后是单质银；所述O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液浓度为0.1- 0.5 mg/mL；所述氧化石墨烯分散液浓度为0.1-0.5 mg/mL。
上述技术方案是在本课题组项目研究的基础上，深入探讨了纳米粒子与氧化石墨烯组装过程。首先采用光化学还原法制备O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液，再将该分散液与氧化石墨烯分散液混合超声，本发明基壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料的制备方法具有的工艺特点和优越性如下。
O-羧甲基壳聚糖覆盖于纳米银表面，在水溶液中O-羧甲基壳聚糖包裹的纳米银通过O-羧甲基壳聚糖与氧化石墨烯的氢键作用进行自组装，O-羧甲基壳聚糖覆盖于纳米银可均匀负载在氧化石墨烯表面，整个反应过程无需加热，制备方法简单、快捷、耗能小。
O-羧甲基壳聚糖在纳米银制备过程中充当还原剂和稳定剂，制备过程不引入其他无抗菌效果或有毒试剂，使用安全可靠，可广泛用于医疗、卫生、环境治理，功能涂料、纺织品抗菌整理等领域。
附图说明
图1是本发明壳聚糖包裹纳米银/氧化石墨烯自组装复合抗菌材料的X射线衍射谱图。图中可见在2θ=9.7o、38.1o、44.3o、64.4o和77.3o出现五个特征衍射峰，其中9.7o的衍射峰是氧化石墨烯的特征峰。通过与JCPDS(4-0781)标准卡片对比，我们可以知道38.1o、44.3o、64.4o和77.3o这四个衍射峰分别是对应着立方相金属银的(111)、(200)、(220)和(311)四个晶面的衍射峰。表明本发明所制备的是含有氧化石墨烯和纳米银的复合抗菌剂，其中的银是立方结构晶系的单质银。
具体实施方式
本发明上述所提供的一种O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料是按硝酸银溶液和O-羧甲基壳聚糖溶液进行混合后，经紫外光照射，将获得的的悬浮液进行离心、洗涤、水溶液分散，并与氧化石墨烯分散液按体积比为1:5-5:1混合制得。
下面通过具体实施例来进一步详细说明本发明的具体实施方式。
实施例1
(1) 将0.1%wt硝酸银溶液与0.1%wt O-羧甲基壳聚糖溶液按体积比为5:95加入搅拌器，室温下搅拌1h。
(2) 将上述混合溶液置于4mL石英比色皿中，通氮气20s除尽空气并密封。
(3) 将石英比色皿置于272nm紫外灯5cm处照射15min，紫外灯功率20w。
(4) 将混合溶液中加入一倍体积无水乙醇在14000r/min转速下离心60min取沉淀，并用50%wt乙醇离心洗涤两次。
(5) 沉淀再次溶于超纯水，并超声处理10min，即得O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液。
(6) 将0.1 mg/mL O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液与0.1 mg/mL氧化石墨烯分散液按体积比为5:1混合，超声处理10min，得到O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料。
通过上述制备方法中，硝酸银溶液与O-羧甲基壳聚糖溶液的体积之比为5:9.5，O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液与氧化石墨烯分散液按体积比为5:1。
微量肉汤稀释法最小抑菌浓度试验：
将大肠杆菌(ATCC11229)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的菌种分别以划线法接种到配置好的营养琼脂上，置于恒温培养箱中在下培养后，取典型的菌落移种到营养肉汤培养基中，再次培养，用营养肉汤对菌悬液进行稀释，配制成105CFU/mL细菌悬液备用。
选取灭菌的96孔聚苯乙烯板中并排的八个孔，每孔依次加入双倍浓度的灭菌MH(B)完全培养基100μL、105CFU/mL细菌悬液50μL和倍比稀释后不同浓度的O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料50μL。此时第1孔至第8孔药物浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。将96孔聚苯乙烯板置于37o培养箱内培养24h，用酶标仪检测630nm处各孔的OD值。
试验结果表明本实施例O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银/氧化石墨烯自组装复合抗菌材料对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1 µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2 µ/mL。
实施例2
按照实施例1的工艺方法，实施例2的区别在于：O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液与氧化石墨烯分散液按体积比为3:3。
微量肉汤稀释法最小抑菌浓度试验同实施例1。
试验结果表明本实施例O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料对大肠杆菌的最小抑菌浓度为4 µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为4 µ/mL。
实施例3
按照实施例1的工艺方法，实施例3的区别在于：O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银分散液与氧化石墨烯分散液按体积比为2:4。
微量肉汤稀释法最小抑菌浓度试验同实施例1。
试验结果表明本实施例O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银氧化石墨烯复合抗菌材料对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.25 µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1 µ/mL。