运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法。

背景技术：

结缕草(Zoysia japonica Steud)属于禾本科，是一种多年生的暖季型草坪草，其具有抗旱、抗病和耐粗放管理等优良的特点；在暖季型草坪草中抗寒性最强，由于其具有很强的耐践踏能力及其恢复能力强的特点，被广泛应用于运动场草坪。但与冷季型草坪草比较，他的绿期相对较短，在改进其绿期方面，利用传统的育种手段已经无法从根本上解决此问题；随着分子育种技术的发展，利用遗传转化技术为解决此问题提供了可能；一个高效的组织培养体系是遗传转化体系的核心，而组织培养体系受到物种的基因型限制，不同的基因型品种对结缕草的组织培养体系具有很大的影响。本发明使用的是结缕草Compadre品种，此品种是从美国HANCOCK种子公司引种而来的优质草种，目前在国内得到很好的适应，但目前尚未有关Compadre组织培养体系建立的报道。

目前已有一些有关结缕草其它品种的组织培养体系的报道，1989年，Al-Khayri等人利用种子作为外植体，首次建立了结缕草组织培养体系，Asano 1989；Asano et al.1996；Poeaim et al.2004；Xun Wang et al.2010等利用不同结缕草品种建立了组织培养体系，但有一点是公认的，不同的基因型结缕草品种的组织培养体系的配方，生长周期、愈伤诱导率和再生率存在很大的区别。Compadre作为一种优质的品种，具有优质的色泽、抗旱、抗病和耐粗放管理等优良特性，在美国的运动场已经得到广泛的应用；自2009年引种到国内，在北京地区也得到良好的适应；但其也具备结缕草普遍具有的缺陷，就是绿期相对较短，目前结缕草Compadre缺乏一套高效的组织培养体系，本发明以此为目的，以此为利用遗传转化技术解决结缕草Compadre绿期短的问题奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法。

本发明采用的技术方案如下：

通过种子无菌处理，愈伤诱导，芽的分化，生根的培养和植物生长调节剂的选择，探索结缕草Compadre在组织培养过程的各种条件，首次建立了结缕草Compadre的组织培养体系，为利用遗传转化技术改良结缕草Compadre奠定基础。

具体地说，本方法包括以下步骤：

①外植体选取与消毒；

②改良培养基的配备；

③愈伤诱导；

④愈伤继代；

⑤芽分化；

⑥生根培养；

⑦炼苗与移栽；

对培养基的改良方法如下：

对MS培养基进行改良，配方为：在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其他组分均无变化；pvp-40的浓度为0.1-1mg/L，酸水解酪蛋白浓度为0.15-0.5mg/L；

配备用于愈伤诱导的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添2,4-D、6-BA、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为1-8mg/L，6-BA的浓度为0.1-1mg/L，维生素B1的浓度为1-10mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50-600mg/L；

配备用于愈伤继代的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、TDZ、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为1-8mg/L，6-BA的浓度为0.1-1mg/L，TDZ的浓度为0.01-0.1mg/L，维生素B1的浓度为1-10mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50-600mg/L；

配备芽分化的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添加TDZ、NAA、GA和麦芽糖；其中TDZ的浓度为0.5-3mg/L，NAA的浓度为0.01-0.4mg/L，GA的浓度为0.05-0.5mg/L，麦芽糖的浓度20-40mg/L；

配备生根培养基，配方为：将改良的MS培养基营养元素减半，再添加蔗糖和琼脂；其中蔗糖的浓度为10-30mg/L，琼脂的浓度为8-12mg/L；

所有阶段的培养环境为：光照为40-80μE/m²/s，温度为26-28℃，培养基的pH为5.6-6.0。

本发明具有下列优点和积极效果：

①利用本发明所述的培养基配方和利用种子作为外植体，首次建立了结缕草Compadre组织培养体系，其中愈伤诱导率为75.2％，胚性愈伤率为60.2％，芽的分化率为58.3％，生根率为95.3％，组培苗移入土中成活率为98.3％；

②从种子诱导愈伤到获得体外植株，总周期为135天，高效建立了利用组织培养的方法来实现结缕草Compadre快速繁殖的体系，其中大部分指标均高于其他同类结缕草品种；

③以此为利用遗传转化技术来解决结缕草绿期短的问题奠定了基础，更好地推动了运动场草坪事业的发展。

附图说明

图1是本方法的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。

一、优选

1、改良的MS培养基中的pvp40为0.5mg/L，酸水解酪蛋白为0.25mg/L；

2、所述用于愈伤诱导培养基2,4-D的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L，维生素B1的浓度为5mg/L，α-酮戊二酸的浓度为120mg/L；

3、所述用于愈伤继代培养基2,4-D的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L,TD的浓度为0.05mg/L，维生素B1的浓度为5mg/L，α-酮戊二酸的浓度为120mg/L；

4、在所述用于芽分化培养基中，TDZ的浓度为1.2mg/L，NAA的浓度为0.05mg/L，GA的浓度为0.1mg/L，麦芽糖的浓度为30mg/L；

5、在所述用于生根培养基中，1/2MS营养元素更适合生根，蔗糖的浓度为10mg/L，琼脂的浓度为9g/L；

6、在所述用于结缕草Compadre最适合的组织培养条件为，光照为60μE/m²/s，温度为28℃，pH为5.8。

二、实施例

1、实施例1

本方法包括以下步骤：

①外植体挑选与灭菌

A、选取子粒饱满的结缕草Compadre种子作为外植体；

B、用70％酒精灭菌2min，先对种子进行表面消毒，消毒完用蒸馏水清洗3次；

C、用40％的次氯酸钠(有效Cl为10％)灭菌45min，加入0.1mL吐温20，并放在磁力搅拌器上进行搅拌，时间到后，在超净工作台上用500mL的无菌水进行清洗，再加入50mL无菌水放入4℃冰箱中低温春化24h；

D、在超净工作台上将春化过的种子放在无菌滤纸上吹干；

②对基础MS培养基进行改良

在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其中pvp40浓度为0.2mg/L，酸水解酪蛋白的浓度为0.15mg/L，其他成分不变；

③愈伤诱导

将步骤①中灭菌的种子，播种到愈伤诱导培养基中，大约50颗/皿，用锡纸包裹，放置在温度为28±1℃条件下进行暗培养，培养20-23天，有愈伤长出；

所述用于愈伤诱导培养基的配方为：在改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为2mg/L,6-BA的浓度为0.1mg/L，维生素B1的浓度为2mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50mg/L，除以上另外加入蔗糖的量为30g/L，植物凝胶为3g/L，培养基的pH为5.6；

④愈伤继代培养

将步骤③培养30-35天诱导出来的愈伤进行拔芽继代培养，挑选出比较大的愈伤，将种壳和芽拔掉，将白色絮状的愈伤放入到继代培养基中，大约35-40颗/皿，每隔2周继代一次，继代3-4次的愈伤可以用于下一步实验；继代培养的条件为：温度为28±1℃暗培养；所述用于愈伤继代培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、TDZ、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为2mg/L，6-BA的浓度为0.1mg/L，维生素B1的浓度为2mg/L，TDZ的浓度为0.05mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50mg/L，除以上另外加入蔗糖的量为30g/L，琼脂为8g/L，培养基的pH为5.6；

⑤芽分化

将步骤④继代3次以上的愈伤挑选出来放入芽的分化培养基中进行芽的分化，尽量挑选出个比较大的和有些浅绿色的愈伤；芽分化培养的条件为：光照强度为40μE/m²/s，温度为28±1℃，16h光照，8h黑暗；所述用于芽的分化培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加TDZ、NAA、GA和麦芽糖，其中TDZ的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.02mg/L，GA的浓度为0.05mg/L，麦芽糖的浓度为20mg/L，除以上之外，另外加入8g/L琼脂，pH为5.6；

⑥生根培养

将步骤⑤生长到10㎝以上的不定芽挑选出来放入到生根培养基上进行生根培养，培养15-20天，将会有根长出来，生根培养的条件为：光照强度为40μE/m²/s，温度为28±1℃，16h光照，8h黑暗；所述用于生根培养的配方为：将改良的MS培养基营养元素减半，再添加蔗糖和琼脂；其中蔗糖的浓度为10mg/L，琼脂的浓度为9g/L，pH为5.6；

⑦炼苗与移栽

打开瓶盖，将步骤⑥生长有足够根的组培苗炼苗24h，然后移入到土中，放在光照为40μE/m²/s，温度为28±1℃的温室中成长，所述的土的配比为：草炭：蛭石：珍珠岩＝1：1：1。

2、实施例2

本方法包括以下步骤：

①外植体挑选与灭菌

A、选取子粒饱满的结缕草Compadre种子作为外植体；

B、用70％酒精灭菌2min，先对种子进行表面消毒，2min后，用蒸馏水清洗3次；

C、用40％的次氯酸钠(有效Cl为10％)灭菌45min，加入0.1mL吐温20，并放在磁力搅拌器上进行搅拌，时间到后，在超净工作台上用500mL的无菌水进行清洗，再加入50mL无菌水放入4℃冰箱中低温春化24h；

D、在超净工作台上将春化过的种子放在无菌滤纸上吹干；

②对基础MS培养基进行改良

在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其中pvp40浓度为0.5mg/L,酸水解酪蛋白浓度为0.25mg/L，其他成分不变；

③愈伤诱导

将步骤①灭菌的种子，播种到愈伤诱导培养基中，大约50颗/皿，用锡纸包裹，放置在温度为28±1℃条件下进行暗培养，培养20-23天，有愈伤长出；所述用于愈伤诱导培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L，维生素B1的浓度为5mg/L，α-酮戊二酸的浓度为120mg/L，除以上另外加入蔗糖的量为30g/L，植物凝胶为3g/L，培养基的pH为5.8；

④愈伤继代培养

将步骤③培养30-35天诱导出来的愈伤进行拔芽继代培养，挑选出比较大的愈伤，将种壳和芽拔掉，将白色絮状的愈伤放入到继代培养基中，大约35-40颗/皿，每隔2周继代一次，继代3-4次的愈伤可以用于下一步实验，继代培养的条件为：温度为28±1℃暗培养；所述用于愈伤继代培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、TDZ、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L，维生素B1的浓度为5mg/L，TDZ的浓度为0.05mg/L，α-酮戊二酸的浓度为120mg/L，除以上另外加入蔗糖的量为30g/L，琼脂为8g/L，培养基的pH为5.8；

⑤芽的分化

将步骤④继代3次以上的愈伤挑选出来放入芽的分化培养基中进行芽的分化，尽量挑选出，个数较大的，有些浅绿色的愈伤；芽分化培养的条件为：光照强度为60μE/m²/s，温度为28±1℃，16h光照，8h黑暗；所述用于芽的分化培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加TDZ、NAA、GA和麦芽糖，其中TDZ的浓度为1.2mg/L，NAA的浓度为0.05mg/L，GA的浓度为0.1mg/L，麦芽糖的浓度为30mg/L，除以上之外，另外加入8g/L琼脂，pH为5.8；

⑥生根培养

将步骤⑤生长到10㎝以上的不定芽挑选出来放入到生根培养基上进行生根培养，培养15-20天，将会有根长出来，生根培养的条件为：光照强度为60μE/m²/s，温度为28±1℃，16h光照，8h黑暗；所述用于生根培养的配方为：将改良的MS培养基营养元素减半，再添加蔗糖和琼脂；其中蔗糖的浓度为20mg/L，琼脂的浓度为10g/L，pH为5.8；

⑦炼苗与移栽：

打开瓶盖，将步骤⑥生长有足够根的组培苗炼苗24h，然后移入到土中，放在光照为60μE/m²/s，温度为28±1℃的温室中成长，所述的土的配比为：草炭：蛭石：珍珠岩＝1：1：1。

3、实施例3

本方法包括以下步骤：

①外植体挑选与灭菌

A、选取子粒饱满的结缕草Compadre种子作为外植体；

B、用70％酒精灭菌2min，先对种子进行表面消毒2min后，用蒸馏水清洗3次；

C、用40％的次氯酸钠(有效Cl为10％)灭菌45min，加入0.1mL吐温20，并放在磁力搅拌器上进行搅拌，时间到了之后，在超净工作台上用500mL的无菌水进行清洗，再加入50mL无菌水放入4℃冰箱中低温春化24h；

D、在超净工作台上将春化过的种子放在无菌滤纸上吹干；

②对基础MS培养基进行改良

在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其中pvp40浓度为1mg/L，酸水解酪蛋白浓度为0.5mg/L，其他成分不变。

③愈伤诱导:

将步骤①灭菌的种子，播种到愈伤诱导培养基中，大约50颗/皿，用锡纸包裹，放置在温度为28±1℃条件下进行暗培养，培养20-23天，有愈伤长出，所述用于愈伤诱导培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为8mg/L，6-BA的浓度为0.9mg/L，维生素B1的浓度为10mg/L，α-酮戊二酸的浓度为450mg/L，除以上另外加入蔗糖的量为30g/L，植物凝胶为3g/L，培养基的pH为6.0；

④愈伤继代培养

将步骤③培养30-35天诱导出来的愈伤进行拔芽继代培养，挑选出个数较大的愈伤，将种壳和芽拔掉，将白色絮状的愈伤放入到继代培养基中，大约35-40颗/皿，每隔2周继代一次，继代3-4次的愈伤可以用于下一步实验；继代培养的条件为：温度为28±1℃暗培养；所述用于愈伤继代培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、TDZ、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为8mg/L，6-BA的浓度为0.9mg/L，维生素B1的浓度为10mg/L，TDZ的浓度为0.05mg/L，α-酮戊二酸的浓度为450mg/L，除以上另外加入蔗糖的量为30g/L，琼脂为8g/L，培养基的pH为6.0；

⑤芽分化

将步骤④继代3次以上的愈伤挑选出来放入芽的分化培养基中进行芽的分化，尽量挑选出个数较大的，有些浅绿色的愈伤；芽分化培养的条件为：光照强度为80μE/m²/s，温度为28±1℃，16h光照，8h黑暗；所述用于芽的分化培养基的配方为：改良的MS培养基的基础上添加TDZ、NAA、GA和麦芽糖，其中TDZ的浓度为2.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L，GA的浓度为0.35mg/L，麦芽糖的浓度为40mg/L，除以上之外，另外加入8g/L琼脂，pH为6.0；

⑥生根培养

将步骤⑤生长到10㎝以上的不定芽挑选出来放入到生根培养基上进行生根培养，培养15-20天，将会有根长出来；生根培养的条件为：光照强度为80μE/m²/s，温度为28±1℃，16h光照，8h黑暗；所述用于生根培养的配方为：将改良的MS培养基营养元素减半，再添加蔗糖和琼脂；其中蔗糖的浓度为30mg/L，琼脂的浓度为12g/L，pH为6.0；

⑦炼苗与移栽：

打开瓶盖，将步骤⑥生长有足够根的组培苗炼苗24h，然后移入到土中，放在光照为80μE/m²/s，温度为28±1℃的温室中成长，所述的土的配比为：草炭：蛭石：珍珠岩＝1：1：1。

三、实施例对比

1、实施例1与实施例2对比

区别在于愈伤诱导培养基、继代培养基、芽的分化培养基、生根培养基中，除都使用改良的基础培养基相同外，其在营养成分，植物生长调节剂有加入的量上的不同，培养的环境条件也有较大的改变。

结果显示，实施例1的愈伤诱导率为60.3％，胚性愈伤率为48.2％，芽的分化率为44.6％，生根率为96.7％，组培苗移入土中成活率为97.5％，从种子诱导愈伤到获得体外的植株，总周期为150天；实施例2的愈伤诱导率为75.2％，胚性愈伤率为60.2％，芽的分化率为58.3％，生根率为95.3％，组培苗移入土中成活率为98.3％，从种子诱导愈伤到获得体外植株，总周期为135天；由此分析得出，实施例1的生根率要优于实施例2，但综合各项指标分析，实施例2总体效果要优于实施例1，实施例2组织培养体系要优于实施例1。

2、实施例3与实施例2对比

区别在于愈伤诱导培养基、继代培养基、芽的分化培养基、生根培养基中，除使用改良的基础培养基相同外，其在营养成分，植物生长调节剂有加入的量上的不同，培养的环境条件也有较大的改变，结果显示，实施例3愈伤诱导率为65.3％，胚性愈伤率为52.3％，芽的分化率为50.4％，生根率为89.4％，组培苗移入土中成活率为97.8％，从种子诱导愈伤到获得体外植株，总周期为160天；实施例2的愈伤诱导率为75.2％，胚性愈伤率为60.2％，芽的分化率为58.3％，生根率为95.3％，组培苗移入土中成活率为98.3％，从种子诱导愈伤到获得体外植株，总周期为135天；由此分析得出，实施例2的各项指标均高于实施例3，实施例2的组织培养体系要优于实施例3。

四、本方法的流程

如图1，实施例2的流程如下：

①将灭菌的种子播种于愈伤诱导培养基中-A；

②在愈伤诱导培养基诱导20天-B；

③将愈伤拔芽后第1次继代-C；

④将愈伤继代3次-D；

⑤将愈伤放入到芽分化培养基中诱芽25天-E；

⑥将10㎝以上的芽放入生根培养基上进行生根-F；

⑦生根培养基生根20天-G；

⑧将组培苗移入土中生长15天-H。