本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种树莓的组织培养方法。
背景技术：
树莓，又称覆盆子，属蔷薇科悬钩子属，是一种多年生小灌木类落叶果树。树莓的适应性广，长势强。在我国北方地区分布广泛，树莓是当今世界发展最为迅速、集营养与保健于一身的第三代黄金水果。目前对树莓的研究和开发主要集中于树莓引种和果实的加工利用。树莓常规的繁殖方法有分根法、分株法、扦插法和压条法等，但上述繁殖方法繁殖速度慢，培养出的苗木繁育能力差、果实小、易脱落、产量低，且对母本材料要求高，用量大，还受到季节的限制，难以进行规模化、标准化生产和优良品种的大面积推广。此外，目前运用组织培养方法繁殖生产种苗的方法成本较高、培养周期较长。
因此，需要寻找一套新的成本低、时间短、成活率高的无性繁殖体系来扩大树莓繁殖量，可以较好的提高种苗的繁育能力，且种苗栽种后，成果率高，质量好，进行树莓苗木的产业化生产，以满足市场需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于：针对上述存在的不足，本发明提供了一种树莓的组织培养方法，提供树莓离体组培快繁的成套技术，每个阶段采用不同的激素调节，达到提高增殖率和减少变异的目的，成活种苗便于运输，且对母本材料要求低、成本低、时间短、成活率高、产品质量好，实现了树莓种苗的规模化、标准化生产，得到优质种苗。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种树莓的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）外植体选取和消毒：选取树莓苗的2.5～3cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体，去掉叶片后，用流水冲洗25～35min；若树莓外植体表面带有绒毛，用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗30～40min，然后再进行消毒处理；
（2）诱导培养：将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体，在无菌的条件下接种于诱导培养基中，于22～26℃温度下培养20～30d，光周期为10～12h/d,进行诱导培养，培养至外植体萌发叶分化成芽丛，切下芽丛，而外植体继续在诱导培养基中，反复诱导培养至长出新芽丛，以20～30d为周期转接继代一次；
（3）增殖培养：将步骤（2）切下的芽丛转接至增殖培养基中，于25～30℃温度下培养40～50d，光周期为10～12h/d，进行增殖培养，每30～35d继代一次，得增殖倍数为2.5～3的芽丛，如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛，并使芽丛长成2～3节、高2～3cm的芽苗，切下；
（4）生根培养：将步骤（3）切下的芽苗分成单株，接种到生根培养基中诱导生根，培养20～30d至每株生根4～6条，根长2～3cm；
（5）炼苗与移栽：将生根苗移到大棚7～9d后，用温清水将苗上培养基洗净，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒2～3min后再移栽。
进一步地，在步骤（1），所述外植体消毒为：在无菌超净台中，将清洗过的外植体依次在体积浓度为75％的酒精中消毒处理25～35s、在质量浓度为0.1～0.15％的氯化汞中灭菌处理7～9min、在体积浓度为1.5～2％的次氯酸钠溶液中消毒处理20～25min，再用无菌水冲洗5～6次，即可。
进一步地，在步骤（2），所述诱导培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.3～0.6mg、萘乙酸0.2～0.4mg、白砂糖30～35g和琼脂粉6～7g，ph=5.8～6.0。
进一步地，在步骤（3），所述增殖培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.6～1.0mg、吲哚乙酸0.1～0.5mg和白砂糖35～40g，ph=5.8～6.0。
进一步地，在步骤（4），所述生根培养基为：以1/2ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.2～0.3mg、康基腺嘌呤0.1～0.3mg、萘乙酸0.1～0.3mg和琼脂粉4～6g，ph=5.8～6.0。
进一步地，在步骤（5），所述炼苗与移栽为：将生根苗直接移栽到由栽培土与腐殖土按重量比1：1.5～2组成的基质中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在22～28℃，湿度为75～85%；或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1：1.5～2.5组成的苗床中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在22～28℃，湿度为75～85%。
进一步地，在步骤（2）、（3）及（4），所述诱导培养、增殖培养和生根培养的光照强度均为1500～2000lx。
本发明中，所述酒精、氯化汞溶液、次氯酸钠溶液、无菌水、6-苄基嘌呤、萘乙酸、吲哚乙酸、康基腺嘌呤、白砂糖、琼脂粉、细河沙和腐殖土均为市面上销售的常规产品。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下积极效果：
（1）本发明用带芽茎段和茎尖作为外植体，对外植体消毒杀菌处理后，并对该外植体进行反复多次诱导，获得大量芽丛，然后经过增殖培养和生根培养，增殖系数为13～16，生根率高达98%，再经炼苗与移栽，采用特殊的基质及合理的栽培条件，获得大量种苗，无需通过采集大量外植体来获得无菌苗，移栽成活率可达95%以上。
（2）本发明提供树莓离体组培快繁的成套技术，每个阶段采用不同的激素调节，达到提高增殖率和减少变异的目的，成活种苗便于运输，且对母本材料要求低、成本低、时间短、成活率高、产品质量好，实现了树莓种苗的规模化、标准化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明一种树莓的组织培养方法，作进一步说明。
实施例1
一种树莓的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）外植体选取和消毒：选取树莓苗的2.5cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体，去掉叶片后，用流水冲洗25min；若树莓外植体表面带有绒毛，用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗30min，然后再进行消毒处理；所述外植体消毒为：在无菌超净台中，将清洗过的外植体依次在体积浓度为75％的酒精中消毒处理25s、在质量浓度为0.1％的氯化汞中灭菌处理7min、在体积浓度为1.5％的次氯酸钠溶液中消毒处理20min，再用无菌水冲洗5次，即可；
（2）诱导培养：将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体，在无菌的条件下接种于诱导培养基中，于22℃温度下培养20d，光周期为10h/d，光照强度为1500lx，进行诱导培养，培养至外植体萌发叶分化成芽丛，切下芽丛，而外植体继续在诱导培养基中，反复诱导培养至长出新芽丛，以20d为周期转接继代一次；所述诱导培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.3mg、萘乙酸0.2mg、白砂糖30g和琼脂粉6g，ph=5.8～6.0；
（3）增殖培养：将步骤（2）切下的芽丛转接至增殖培养基中，于25℃温度下培养40d，光周期为10h/d，光照强度为1500lx，进行增殖培养，每30d继代一次，得增殖倍数为2.5的芽丛，如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛，并使芽丛长成2～3节、高2～3cm的芽苗，切下；所述增殖培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.6mg、吲哚乙酸0.1mg和白砂糖35g，ph=5.8～6.0；
（4）生根培养：将步骤（3）切下的芽苗分成单株，接种到生根培养基中诱导生根，光照强度为1500lx，培养20d至每株生根4～6条，根长2～3cm；所述生根培养基为：以1/2ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.2mg、康基腺嘌呤0.1mg、萘乙酸0.1mg和琼脂粉4g，ph=5.8～6.0；
（5）炼苗与移栽：将生根苗移到大棚7d后，用温清水将苗上培养基洗净，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒2min后再移栽；所述炼苗与移栽为：将生根苗直接移栽到由栽培土与腐殖土按重量比1：1.5组成的基质中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在22℃，湿度为75%；或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1：1.5组成的苗床中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在22℃，湿度为75%。
实施例2
一种树莓的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）外植体选取和消毒：选取树莓苗的3cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体，去掉叶片后，用流水冲洗35min；若树莓外植体表面带有绒毛，用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗40min，然后再进行消毒处理；所述外植体消毒为：在无菌超净台中，将清洗过的外植体依次在体积浓度为75％的酒精中消毒处理35s、在质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌处理9min、在体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒处理25min，再用无菌水冲洗6次，即可；
（2）诱导培养：将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体，在无菌的条件下接种于诱导培养基中，于26℃温度下培养30d，光周期为12h/d，光照强度为2000lx，进行诱导培养，培养至外植体萌发叶分化成芽丛，切下芽丛，而外植体继续在诱导培养基中，反复诱导培养至长出新芽丛，以30d为周期转接继代一次；所述诱导培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.6mg、萘乙酸0.4mg、白砂糖35g和琼脂粉7g，ph=5.8～6.0；
（3）增殖培养：将步骤（2）切下的芽丛转接至增殖培养基中，于30℃温度下培养50d，光周期为12h/d，光照强度为2000lx，进行增殖培养，每35d继代一次，得增殖倍数为3的芽丛，如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛，并使芽丛长成2～3节、高2～3cm的芽苗，切下；所述增殖培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤1.0mg、吲哚乙酸0.5mg和白砂糖40g，ph=5.8～6.0；
（4）生根培养：将步骤（3）切下的芽苗分成单株，接种到生根培养基中诱导生根，光照强度为2000lx，培养30d至每株生根4～6条，根长2～3cm；所述生根培养基为：以1/2ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.3mg、康基腺嘌呤0.3mg、萘乙酸0.3mg和琼脂粉6g，ph=5.8～6.0；
（5）炼苗与移栽：将生根苗移到大棚9d后，用温清水将苗上培养基洗净，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒3min后再移栽；所述炼苗与移栽为：将生根苗直接移栽到由栽培土与腐殖土按重量比1：2组成的基质中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在28℃，湿度为85%；或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1：2.5组成的苗床中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在28℃，湿度为85%。
实施例3
一种树莓的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）外植体选取和消毒：选取树莓苗的2.6～2.9cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体，去掉叶片后，用流水冲洗28～32min；若树莓外植体表面带有绒毛，用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗33～37min，然后再进行消毒处理；所述外植体消毒为：在无菌超净台中，将清洗过的外植体依次在体积浓度为75％的酒精中消毒处理27～33s、在质量浓度为0.11～0.14％的氯化汞中灭菌处理7.5～8.5min、在体积浓度为1.6～1.9％的次氯酸钠溶液中消毒处理21～24min，再用无菌水冲洗5～6次，即可；
（2）诱导培养：将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体，在无菌的条件下接种于诱导培养基中，于23～25℃温度下培养23～27d，光周期为10.5～11.5h/d，光照强度为1600～1900lx，进行诱导培养，培养至外植体萌发叶分化成芽丛，切下芽丛，而外植体继续在诱导培养基中，反复诱导培养至长出新芽丛，以23～27d为周期转接继代一次；所述诱导培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.4～0.5mg、萘乙酸0.25～0.35mg、白砂糖31～34g和琼脂粉6.3～6.7g，ph=5.8～6.0；
（3）增殖培养：将步骤（2）切下的芽丛转接至增殖培养基中，于26～29℃温度下培养43～47d，光周期为11h/d，光照强度为1700～1800lx，进行增殖培养，每32～34d继代一次，得增殖倍数为2.6～2.9的芽丛，如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛，并使芽丛长成2～3节、高2～3cm的芽苗，切下；所述增殖培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.7～0.9mg、吲哚乙酸0.2～0.4mg和白砂糖36～39g，ph=5.8～6.0；
（4）生根培养：将步骤（3）切下的芽苗分成单株，接种到生根培养基中诱导生根，光照强度为1600～1800lx，培养22～28d至每株生根4～6条，根长2～3cm；所述生根培养基为：以1/2ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.23～0.27mg、康基腺嘌呤0.15～0.25mg、萘乙酸0.15～0.25mg和琼脂粉4.5～5.5g，ph=5.8～6.0；
（5）炼苗与移栽：将生根苗移到大棚7.5～8.5d后，用温清水将苗上培养基洗净，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒2～3min后再移栽；所述炼苗与移栽为：将生根苗直接移栽到由栽培土与腐殖土按重量比1：1.7～1.8组成的基质中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在24～26℃，湿度为78～82%；或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1：1.8～2.2组成的苗床中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在24～26℃，湿度为78～82%。
实施例4
一种树莓的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）外植体选取和消毒：选取树莓苗的2.7cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体，去掉叶片后，用流水冲洗30min；若树莓外植体表面带有绒毛，用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗35min，然后再进行消毒处理；所述外植体消毒为：在无菌超净台中，将清洗过的外植体依次在体积浓度为75％的酒精中消毒处理30s、在质量浓度为0.13％的氯化汞中灭菌处理8min、在体积浓度为1.8％的次氯酸钠溶液中消毒处理22min，再用无菌水冲洗6次，即可；
（2）诱导培养：将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体，在无菌的条件下接种于诱导培养基中，于24℃温度下培养25d，光周期为11h/d，光照强度为1800lx，进行诱导培养，培养至外植体萌发叶分化成芽丛，切下芽丛，而外植体继续在诱导培养基中，反复诱导培养至长出新芽丛，以25d为周期转接继代一次；所述诱导培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.45mg、萘乙酸0.3mg、白砂糖33g和琼脂粉6.5g，ph=5.8～6.0；
（3）增殖培养：将步骤（2）切下的芽丛转接至增殖培养基中，于27℃温度下培养45d，光周期为11h/d，光照强度为1750lx，进行增殖培养，每33d继代一次，得增殖倍数为2.7的芽丛，如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛，并使芽丛长成2～3节、高2～3cm的芽苗，切下；所述增殖培养基为：以ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.8mg、吲哚乙酸0.3mg和白砂糖37g，ph=5.8～6.0；
（4）生根培养：将步骤（3）切下的芽苗分成单株，接种到生根培养基中诱导生根，光照强度为1700lx，培养25d至每株生根4～6条，根长2～3cm；所述生根培养基为：以1/2ms培养基为基本培养基，每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.25mg、康基腺嘌呤0.2mg、萘乙酸0.2mg和琼脂粉5g，ph=5.8～6.0；
（5）炼苗与移栽：将生根苗移到大棚8d后，用温清水将苗上培养基洗净，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒3min后再移栽；所述炼苗与移栽为：将生根苗直接移栽到由栽培土与腐殖土按重量比1：1.75组成的基质中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在25℃，湿度为80%；或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1：2组成的苗床中，上覆盖塑料拱棚，温度保持在25℃，湿度为80%。
综上所述，本发明用带芽茎段和茎尖作为外植体，对外植体消毒杀菌处理后，并对该外植体进行反复多次诱导，获得大量芽丛，然后经过增殖培养和生根培养，增殖系数为13～16，生根率高达98%，再经炼苗与移栽，采用特殊的基质及合理的栽培条件，获得大量种苗，无需通过采集大量外植体来获得无菌苗，移栽成活率可达95%以上。本发明提供树莓离体组培快繁的成套技术，每个阶段采用不同的激素调节，达到提高增殖率和减少变异的目的，成活种苗便于运输，且对母本材料要求低、成本低、时间短、成活率高、产品质量好，实现了树莓种苗的规模化、标准化生产。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。